Иммунофенотип опухоли что это такое


Прогностическое значение иммунофенотипа злокачественных клеток (на примере острых нелимфобластных лейкозов)

к.м.н. Л.Ю. Андреева, профессор М.А. Волкова, профессор М.А. Френкель

Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина РАМН

Выделение на основании исходных прогностических факторов группы больных, имеющих низкую вероятность достижения ремиссии или высокий риск развития рецидива с целью индивидуализации лечения, является перспективным направлением в современной терапии злокачественных новообразований. Необходимость разработки индивидуальных подходов к терапии различных по прогнозу групп больных продиктована потребностями клиники. Такой подход может основываться только на углубленном изучении молекулярно–биологических особенностей опухолевой клетки. Одним из методов, раскрывающим новые перспективы в понимании антигенных, биохимических и гистогенетических характеристик клеточных структур и дающих возможность глубже понять природу опухоли, особенности ее возникновения, развития и прогрессирования, является иммунофенотипирование. С появлением высокоспецифичных реагентов – моноклональных антител (мкАТ), позволяющих определять и разграничивать специфические антигенные детерминанты, онкологи получили возможность более точного определения диагноза и прогноза заболевания, а также выбора наиболее оптимальной тактики лечения пациента. Неоспоримыми достоинствами иммунофенотипирования являются его высокая чувствительность, специфичность и относительная простота. Данный метод обеспечивает детальную характеристику фенотипа опухоли при диагностике, позволяет идентифицировать отдельные остаточные опухолевые клетки, персистирующие в организме больного во время ремиссии.

Наибольшее развитие метод иммунофенотипирования получил при опухолях крови. Основным и, пожалуй, единственным на сегодняшний день методом лечения гемобластозов является химиотерапия. На примере острых лейкозов наглядно демонстрируется возрастание роли молекулярно–биологических (иммунофенотипических) факторов прогноза по мере интенсификации программ химиотерапии. При этом стандартные прогностические факторы (клинические, гематологические, морфоцитохимические) утрачивают свое значение и отходят на второй план. Эволюция взглядов на факторы прогноза, наблюдаемая при гемобластозах человека и указывающая на возрастание роли иммунофенотипа в условиях современных схем химиотерапии, может явиться своего рода моделью и для ряда соматических опухолей, являющихся объектами химиотерапии, при которых иммунофенотипические подходы пока еще разработаны недостаточно.

Иммунофенотипирование является обязательным методом исследования при гемобластозах в целом и при острых нелимфобластных лейкозах (ОНЛЛ), в частности. Помимо диагностического аспекта, значение изучения иммунофенотипа бластных клеток при ОНЛЛ заключается в том, что наличие некоторых антигенных детерминант ассоциируется с агрессивностью течения и результатами терапии [4, 7, 8, 13, 15, 20]. На сегодняшний день решены еще не все вопросы относительно прогностической ценности экспрессии тех или иных антигенов при ОНЛЛ и последствий, которые влечет за собой их обнаружение с точки зрения лечебной тактики. Представленные в нашей работе результаты отражают общие тенденции комплексного и углубленного изучения иммунофенотипической характеристики ОНЛЛ во взаимосвязи с прогнозом заболевания, которое ведется в крупнейших клиниках мира.

Характеристика больных и методы исследования

Результаты иммунологического исследования и их сопоставление с FAB–вариантами и результатами терапии базируются на данных изучения иммунологического фенотипа бластных клеток 120 больных ОНЛЛ в возрасте от 14 до 67 лет за период с 1981 по 1996 годы, получивших лечение в отделении химиотерапии гемобластозов (руководитель – канд. мед. наук Д.Ш. Османов) РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН. Все пациенты лечились по программам «3+7» стандартными дозами цитозара с различными антрациклиновыми производными – рубомицином (46), аклакуром (20), новантроном (16), идарубицином (38).

Установление диагноза ОНЛЛ и определение морфоцитохимического варианта заболевания осуществлялось в соответствии с критериями FAB–классификации.

Определение иммунологического фенотипа бластных клеток проводилось методом непрямой иммунофлюоресценции с использованием широкой панели моноклональных антител (мкАТ). Набор мкАТ варьировал в разные годы проведения исследований и в наиболее полном виде включал миелоидные (CD11b, CD13, CD14, CD15, CD33), эритроидные (HAE–3, HAE–9), линейно не рестриктированные (CD10, CD34, CD38, HLA–DR), Т–клеточные (CD2, CD4, CD5, CD7) и В–клеточные (CD19, CD22) антигены. Мегакариоцитарные маркеры (CD41, CD61) исследовались по показаниям. Оценка результатов проводилась на проточном цитометре FАСScan (Becton Dickinson, CША) в гейте бластных клеток, идентифицируемых на основании характеристик светорассеяния. Антиген–положительными считались случаи с экспрессией маркера на более чем 20% лейкемических клеток.

Сравнение влияния иммунологических маркеров на частоту полных ремиссий (ПР) больных с наличием или отсутствием экспрессии антигенов на мембране бластных клеток производилось по таблицам сопряженности признаков. Достоверность различий оценивалась по критерию Хи–квадрат. Сравнение кривых общей и безрецидивной выживаемости (ОВ и БРВ соответственно), построенных по методу Каплан–Майера, проводилось с использованием Log–Rank теста. Различия считались достоверными при р < 0,05 (95% точности).

Результаты и обсуждение

Распределение 120 больных с различными морфоцитохимическими вариантами в каждой из лечебных групп представлено в таблице 1. На основании литературных данных и опыта отделения химиотерапии гемобластозов РОНЦ морфоцитохимические варианты ОНЛЛ были разделены на прогностически благоприятные (М1, М2, М3, М4эоз) и прогностически неблагоприятные (М0, М2баз, М4, М5, М6, М7). Во всех группах, за исключением аклакур–цитарабиновой, преобладали прогностически благоприятные FAB–варианты. Статистический анализ во всех 4–х группах не выявил достоверных различий в возрасте, частоте тех или иных клинико–гематологических показателей и клинических симптомов. Результаты использования цитарабина с различными антрациклиновыми производными приведены в табл. 2.

В настоящее время адекватная цитостатическая и симптоматическая терапия позволяет преодолевать многие отрицательные клинико–гематологические факторы, которые до 1980–х годов оказывали решающее влияние на прогноз ОНЛЛ. С возрастанием интенсивности терапии роль некоторых из этих факторов (например, глубины тромбоцитопении и анемии, процентного содержания бластных клеток в крови и костном мозге) полностью нивелировалась, однако другие признаки (возраст, уровень лейкоцитов, морфоцитохимическая характеристика бластных клеток), самостоятельно или в совокупности, по–прежнему сохраняют свою прогностическую значимость [5, 16, 19]. В условиях различных химиотерапевтических режимов роль клинико–гематологических факторов прогноза нами была подтверждена. При этом особенности использованной программы терапии накладывали свой отпечаток на реализацию тех или иных прогностических факторов. Из табл. 3 видно, что при применении современных программ химиотерапии, в частности, при использовании идарубицина, прогностическая роль общепринятых клинико–гематологических и морфоцитохимических факторов практически полностью нивелируется. Таким образом, в условиях интенсивных химиотерапевтических режимов достаточно сложно, опираясь только на вышеуказанные факторы прогноза, определять степень агрессивности опухолевого процесса до начала лечения. С этой целью была проанализирована роль иммунологических особенностей лейкозных клеток больных ОНЛЛ.

Уникальной особенностью бластных клеток при ОНЛЛ является сохранение ими дифференцировочного статуса клеток–предшественников гемопоэза. Однако в отличие от нормальной клеточной дифференцировки, при которой невелик процент клеток, коэкспрессирующих маркеры различных линий и стадий гемопоэза, при ОНЛЛ одновременная экспрессия в норме не встречающихся антигенов определяется в 85% случаях [21]. Таким образом, лейкозный клон клеток, имеющий однородные морфоцитохимические характеристики, является гетерогенным по антигенной структуре бластных элементов, и перспективы иммунофенотипического изучения злокачественных элементов при ОНЛЛ поистине многообразны.

На основании проведенного клинико–иммунологического анализа нам удалось доказать неоднородность терапевтического ответа у больных ОНЛЛ с различным иммунофенотипом бластных клеток. Кроме того, были выявлены иммунологические маркеры, влияющие на отдаленные результаты лечения. Частота экспрессии различных антигенов на поверхности лейкемических клеток и достоверность их влияния на частоту достижения ПР, БРВ и ОВ представлены в табл. 4.

Значение антигена CD10 при ОНЛЛ оценить достаточно сложно ввиду редкости экспрессии данного маркера на мембранах лейкемических клеток. В нашем наблюдении частота CD10–позитивных ОНЛЛ составила 7,8% (9 из 116). Особенностью этих случаев явилась высокая частота ПР – 88,9% (8 из 9). В группе больных, бластные клетки которых не экспрессировали данный маркер, ПР были достигнуты в 54,2% случаев (58 из 107). Уровень значимости различий близок к достоверному (р =0,07). По–видимому, именно большей частотой ПР обусловлены лучшие показатели выживаемости CD10–позитивных пациентов (медиана 21 мес против 6 мес; р = 0,049). Кривые выживаемости в группах, различающихся по экспрессии антигена CD10, представлены на рис. 1. Различия по возрасту, исходному количеству лейкоцитов и количеству больных с благоприятными и неблагоприятными FAB–вариантами в CD10–позитивной и CD10–негативной группе отсутствовали (р>0,5). Первоначально экспрессия антигена CD10 рассматривалась, как признак «лимфоидности». В настоящее время выявлено, что СD10 является дифференцировочным маркером миелоидных клеток и присутствует на поздних стадиях нормальной дифференцировки гранулоцитов [12].

Рис. 1. Общая выживаемость больных ОНЛЛ в зависимости от экспрессии антигена CD10 на поверхности бластных клеток без учета программы терапии.

Напротив, присутствие на бластных клетках миелоидного антигена CD13 ассоциировалось с низкой вероятностью достижения ремиссии (41,7% против 74,2% ПР в CD13–негативной группе; р = 0,07) и, как следствие, со значительно более низкой выживаемостью (медиана 5 ме. против 13 мес соответственно; р = 0,06). Подобные данные есть в литературе [16]. Кроме того, наличие маркера CD13 в иммунофенотипе коррелировало с высоким показателем лейкоцитов в дебюте заболевания. Все случаи ОНЛЛ, сопровождавшиеся экспрессией CD13, характеризовались уровнем лейкоцитов свыше 50 тыс в 1 мкл крови, в то время как при отсутствии этого маркера исходный средний уровень лейкоцитов был в среднем в 2,5 раза ниже (58,8±3,07 тыс/мкл против 23,5± 6,29 тыс/мкл соответственно; р = 0,048). По–видимому, опухолевый клон клеток, характеризующийся экспрессий CD13, обладает высоким пролиферативным потенциалом и крайней агрессивностью течения. Однако значение экспрессии антигена CD13 нельзя считать окончательно установленным. Для более весомого заключения о роли данного маркера нужны дополнительные исследования.

Большое внимание при ОНЛЛ привлекает антиген CD7, как наиболее часто встречающийся «лимфоидный» маркер (20–30% случаев ОНЛЛ). Обычно CD7 присутствует на Т–лимфоцитах и ЕК–клетках, и прежде его считали специфическим лимфоидным антигеном [22]. Впоследствии было установлено, что CD7 может экспрессироваться примитивными гемопоэтическими клетками, в том числе способными к миелоидной дифференцировке [14, 17]. Отсутствие антигена CD7 на бластных клетках было достоверно связано с лучшей безрецидивной выживаемостью (рис. 2). Продолжительность ПР в случаях с экспрессией CD7 составила 5,5 мес; 20 мес без рецидива прожили только 15% больных. В группе пациентов, лейкемические клетки которых не содержали данного антигена, медиана безрецидивной выживаемости составила 15 мес; 20 мес без рецидива прожили 38% больных (p = 0,01). Статистически значимые различия по возрасту, уровню лейкоцитов, количеству больных с благоприятными и неблагоприятными FAB–вариантами между CD7–позитивной и CD7–негативной группами отсутствовали (р > 0,35). Полученные нами данные полностью совпадают с результатами зарубежных исследований [10, 15, 24]. Имеются убедительные данные об ассоциации экспрессии антигена CD7 с наиболее важными факторами неблагоприятного прогноза – фенотипом множественной лекарственной устойчивости, наличием Ph–хромосомы, а также сложными нарушениями кариотипа [11, 23]. По–видимому, выделение CD7–позитивных больных ОНЛЛ в группу, требующую исходной интенсификации терапии, оправдано с клинических позиций.

Рис. 2. Безрецидивная выживаемость больных ОНЛЛ в зависимости от экспрессии антигена CD7 на поверхности бластных клеток без учета программы терапии.

Установление экспрессии антигена CD34 позволяет диагностировать особую подгруппу ОНЛЛ, в которой злокачественная трансформация произошла на уровне полипотентной стволовой клетки. Как видно из рис. 3, экспрессия данного маркера на лейкемических бластах была статистически достоверно связана с более короткой продолжительностью ПР. Так, у больных с наличием маркера CD34 в иммунофенотипе медиана продолжительности ПР составила 10 мес. Ни у кого из больных длительность ремиссии не превысила 12 мес. В то же время в группе больных, на бластных клетках которых отсутствовала экспрессия стволовоклеточного антигена, медиана продолжительности ПР составила 17 мес; 2 года и более без рецидива прожили более 40% больных (р = 0,01). Кроме того, обнаружение CD34 антигена на мембране бластных клеток связано с более низкой частотой ремиссии (42,9%) по сравнению с CD34–негативными случаями (67,2%). Видимо, малочисленность CD34+ группы является причиной того, что выраженные различия в частоте получения ремиссий не являются статистически значимыми. Необходимо отметить, что в группе больных, лейкемические клетки которых экспрессировали стволовоклеточный антиген, отмечался более молодой возраст (30,3±7,2 лет против 40,1±2,3 лет соответственно; р = 0,3) и отсутствие экстрамедуллярных проявлений заболевания, в то время как у 8 (25,8%) из 31 CD34–негативных пациентов такие проявления были; различий по другим клиническим и гематологическим показателям отмечено не было (р > 0,95).

Рис. 3. Безрецидивная выживаемость больных ОНЛЛ в зависимости от экспрессии антигена CD34 на поверхности бластных клеток без учета программы терапии.

Ассоциация экспрессии антигена СD34 с рефрактерностью к терапии и высоким риском развития рецидива прослежена и в других наблюдениях [3, 9, 13]. Клинические данные подтверждаются данными экспериментальных исследований. Boekhonrst R.A.W. c cоавт. [6] продемонстрировали значительное снижение накопления даунорубицина в CD34+ клетках по сравнению с CD34– клетками. В экспериментах с двойной меткой CD34+ клетки значительно меньше накапливали даунорубицин, чем CD34– клетки (17% против 64%, соответственно). В исследовании Lanza F. с соавт. [18] показано, что больные ОНЛЛ, имеющие CD34+ фенотип бластных клеток, характеризуются более низким процентом Кi67–позитивных (т.е делящихся) клеток и увеличением количества «покоящихся» клеток. По–видимому, больные с СD34+ иммунофенотипом могут быть менее восприимчивы к химиотерапевтическим режимам вследствие низкого митотического уровня бластных клеток.

Вопрос о прогностической роли эритроидных антигенов крайне затруднительный. Это объясняется тем, что в зарубежных клиниках гликофорин А (отечественные мкАТ – НАЕ–3) исследуется только по показаниям (для дифференциальной диагностики М6 ОНЛЛ), а экспрессия антигена эритробластов (мкАТ – НАЕ–9) не изучается (эти мкАТ получены в лаборатории акад. Г.И.Абелева РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН и используются только в нашей стране). Поэтому вопрос о прогностической значимости эритроидных антигенов во многом остается открытым. В нашем наблюдении экспрессия бластными клетками гликофорина А была ассоциирована с более короткой продолжительностью ПР (медиана 1,5 мес против 16 мес; р = 0,02). Данный антиген был изучен у 44 больных и в 3–х случаях он был позитивным, что составляет 7% и соответствует частоте встречаемости острого эритробластного лейкоза, для которого он является патогномоничным. В наших более ранних исследованиях негативное влияние на БРВ обоих эритроидных маркеров оказалось взаимодополняющим [1]. Несомненно, для окончательного заключения требуется дополнительный набор материала. Однако полученная даже на небольшой выборке достоверная корреляция свидетельствует о недостаточности стандартной цитозар–антрациклиновой терапии для лечения больных с М6 вариантом ОНЛЛ.

Как видно из изложенных выше данных, нами установлен ряд факторов, ассоциированных с продолжительностью болезни и ремиссии у больных ОНЛЛ, проанализированных без учета используемого антрациклинового производного. Располагая достаточно большим клиническим материалом, накопленным за 15 лет наблюдения, в течение которых в отделении химиотерапии гемобластозов РОНЦ РАМН использовались 4 программы химиотерапии, и, принимая во внимание то, что отдельные иммунофенотипы ОНЛЛ могут иметь особенности в чувствительности к различным антрациклинам, мы попытались провести сравнительное изучение влияния иммунологического фенотипа на результаты лечения в пределах отдельных программ.

Как нами было показано (табл. 3), ни один из клинико–гематологических и морфоцитохимических факторов не оказывал влияния на прогноз ОНЛЛ в условиях применения программы лечения с включением идарубицина. По этой причине мы остановились именно на данной программе с целью демонстрации возрастающей роли иммунологических факторов прогноза у этих конкретных больных.

При использовании идарубицин–цитарабиновой комбинации, как и при других химиотерапевтических программах, сохранялось негативное прогностическое влияние на ОВ и БРВ экспрессии антигена CD7 (р = 0,03). Кривые выживаемости представлены на рис. 4. Кроме того, обнаружение на опухолевых клетках антигена CD34 ухудшало БРВ, при этом разница приближалась к достоверной (p = 0,06). Но вместе с тем выявились маркеры, присутствие которых при применении идарубицина, в отличие от других антрациклиновых производных, значительно улучшало прогноз.

Рис. 4. Общая (А) и безрецидивная (Б) выживаемость больных ОНЛЛ в зависимости от экспрессии антигена CD7 на поверхности бластных клеток при идарубицин-цитарабиновой программе терапии.

При использовании идарубицина отмечался интересный факт: наиболее чувствительными к индукционной терапии были больные с CD38–позитивными бластными клетками. При экспрессии на бластных клетках маркера CD38 частота ПР была более чем вдвое выше, чем при CD38– ОНЛЛ: 68,2% и 33,3% соответственно (р = 0,07). Больные с наличием в иммунофенотипе бластов молекулы CD38 также имели более длительную ПР (рис. 5). Так, 44 и более месяцев без рецидива прожил каждый четвертый больной, на опухолевых клетках которых отмечалась экспрессия CD38 антигена. В то же время длительность безрецидивного периода ни у одного из CD38–негативных больных не превысила 13 меc (р = 0,013).

Рис. 5. Безрецидивная выживаемость больных ОНЛЛ в зависимости от экспрессии антигена CD38 на поверхности бластных клеток при идарубицин-цитарабиновой программе терапии.

Также была отмечена благоприятное прогностическое влияние на ОВ коэкспрессии миелоидных антигенов CD15 и CD33 (медиана 10 мес против 4 мес; р = 0,05) и В–клеточных маркеров CD19 и CD22 (медиана 43 мес против 5 мес; p = 0,032).

Приведенные данные убедительно показывают, что снижение прогностической роли общепринятых клинико–гематологических и морфоцитохимических факторов в условиях современной химиотерапии ОНЛЛ отнюдь не отражает улучшение прогноза у всех больных. Выделить резистентную или, напротив, более благоприятную в прогностическом плане группу позволяют молекулярно–биологические особенности бластных клеток, установленные методом иммунофенотипирования.

Таким образом, приведенные в нашей статье данные свидетельствуют о том, что иммунологическое исследование является необходимым компонентом первичного обследования больных ОНЛЛ. Помимо изучения чисто клинических аспектов, иммунофенотипирование позволяет глубже понять природу этого заболевания и особенности его течения. Выделение на основании исходных прогностических факторов (включая иммунофенотип) групп больных, имеющих низкую вероятность достижения ремиссии или высокий риск развития рецидива, позволяет индивидуализировать лечение и улучшать его результаты [2]. Это перспективное направление в современной терапии злокачественных новообразований в целом и ОНЛЛ, в частности.

Литература:

1. Калетин Г.И., Тупицын Н.Н., Волкова М.А. и др. // Новое в онкологии / Под ред. И.В. Поддубной и Н.А.Огнерубова. – Воронеж, 1997. – С. 11–14.

2. Маркина И.Г., Волкова М.А., Тупицын Н.Н. и др. // Новое в онкологии / Под ред. И.В. Поддубной и Н.А.Огнерубова. – Воронеж, 1999. – С. 5–11.

3. Adamczyk–Cioch M.B., Dmoszyncka A., Hus M. et al. // Pol. Arch. Med. Wewn. – 1995. – Vol. 94(1). – P. 40–46.

4. Baer M.R., Stewart C.C., Lawrence D. et al. // Blood. – 1997. – Vol. 90 (4). – P. 1643–1648.

5. Bennett J.M., Catovsky D., Daniel M.T. // Ann. Int. Med. – 1985. – Vol. 103 – P. 626–629.

6. Boekhonrst R.A.W., Leeun R., Schoester M. et al. // Blood. – 1993. – Vol. 82(10). – P. 3157–3162.

7. Bradstock K., Matthews J., Benson E. et al. // Blood. – 1994. – Vol. 84 (4). – P. 1220–1225.

8. Casasnovas R.O., Solary E., Campos L. et al. // Leuk. Lymphoma. –1994. – Vol. 13(1). – P. 109.

9. Cuneo A., Fagioli F., Passi I. et al. // Leuk. Res. – 1992. –Vol. 16 (8). – P. 789–796.

10. Del Poeta G., Stasi R., Venditti A. et al. // Leuk. Lymphoma. – 1995. – Vol. 17(2). – P. 111–119.

11. Del Poeta G., Stasi R., Venditti A. et al. // Leukemia. – 1994. – Vol. 8(3). – P. 388–394.

12. Greaves M.F. // Cancer Surveys. – 1982. – Vol.1(2). – P.189–204.

13. Guinot M., Sans G.F., Sempere A. et al. // Br. J. Haematol. – 1991. – Vol. 78. – P. 533–534.

14. Haynes B.F., Martin M.E., Kay H.H. et al. // J. Exp. Med. – 1988. – Vol. 168. – P. 1061–1080.

15. Kita K., Miwa H., Nakase K. et al. // Blood. – 1993. – Vol. 81(9). – P. 2399–2405.

16. Kristensen J.S., Hokland R. // Leuk. Res. – 1991. – Vol. 15 (8). – P. 693–700.

17. Kurtzberg J., Denning S.M., Nycum L.M et al. // Proc. Natl. Acad .Sci. USA. – 1989. – Vol. 86. – P. 7575–7579.

18. Lanza F., Rigolin G.M., Moretti S. et al. // Leuk. Lymphoma. – 1994. – Vol. 13. – P. 81–85.

19. Lowenberg B., Downing J.R., Burnett A. // New England J. Med. – 1999. – Vol. 341(14). – P. 1051–1062.

20. Paietta E., Andersen J., Yunis J. et al. // Br. J. Haematol.. – 1998. – Vol. 100(2). – P. 265–272.

21. Reading C.L., Estey E.H., Huh Y.O. et al. // Blood. – 1993. – Vol. 81. – P. 3083–3090.

22. Robertson M.J., Ritz J. // Blood. – 1990. – Vol. 76. – P. 2421–2438.

23. Venditti A., Del Poeta G., Buccisano F. et al. // Leukemia. – 1998. – Vol. 12. – P. 1056–1063.

24. Vidriales M.B., Orfao A., Gonzalez M. et al. // Leukemia. –1993. –Vol. 7(12). – P. 2026–2029.

Поделитесь статьей в социальных сетях

www.rmj.ru

Иммунофенотип и молекулярно-генетическая характеристика анапластической крупноклеточной лимфомы

1201

Одной из основных черт анапластической крупноклеточной лимфомы (АККЛ) является экспрессия CD30 (КМ)-молекулы. CD30 является 120 kDa трансмембранным цитокиновым рецептором из семейства рецепторов фактора некроза опухоли TNF), для которого был установлен лиганд (CD30L). Растворимая 85 kDa-форма CD30 вырабатывается мембраносвязанной молекулой путем протеолитического распада и может быть обнаружена в больших концентрациях в сыворотке крови пациентов. В крупных анапластических опухолевых клетках экспрессия CD30 ограничена мембраной, цитоплазмой и точечной (гранулярной) реакцией (dot-like) в области аппарата Гольджи. В мелкоклеточном варианте только крупные анапластические клетки (чаще сосредоточенные около сосудов) проявляют положительную экспрессию CD30, в то время как мелкие опухолевые клетки чаще являются слабопозитивными или негативными на CD30. Воспроизводимость диагноза АККЛ по морфологическим признакам составляет 46% и может быть увеличена до 85% при иммунном окрашивании на CD30, и, тем не менее, именно иммунные реакции на CD30 должны всегда проводиться параллельно с определением наличия прочих лимфоидных и нелимфоидных маркеров, потому что экспрессия CD30 не является специфической чертой только АККЛ и наблюдается в нормальных активированных клетках других В- и Т-клеточных лимфоидных и нелимфоидных опухолей, а также при негемопоэтических злокачественных заболеваниях, некоторых карциномах и новообразованиях из герминогенных клеток. Однако при анапластической крупноклеточной лимфоме  характерным является выраженная, интенсивная реакция на CD30 в подавляющем большинстве клеток. Другие неоплазмы могут также характеризо-ваться положительной СР30-реакцией, но обычно менее интенсивной и гетерогенной.

Положительная экспрессия эпителиально-мембранного антигена (ЕМА) наблюдается более чем в 50% случаев АККЛ, хотя в некоторых случаях экспрессия положительна только в части опухолевых клеток. Опыт многих работ показал, что экспрессия EMA при АККЛ чаще наблюдается у детей и молодых пациентов и сочетается с благоприятным прогнозом.

В настоящее время ИВХ-реакцию на определение экспрессии ALK-белка принято считать наиболее специфичным диагностическим методом. Современная усовершенствованная генная технология продемонстрировала аномальную экспрессию кластерина (clusterin) при системных АККЛ и ее отсутствие при кожных формах. Наличие кластерина не коррелирует с экспрессией АLК-белка, что характерно для экспрессии BCL-2 и с-Мус. Было установлено, что экспрессия BCL-2 возможна в основном при АLК-негативных вариантах, а ядерная экспрессия с-Мус, напротив, у АLК-позитивных анапластических крупноклеточных лимфом, что позволяет заключить, что наличие АLК-белка может оказывать влияние на индукцию апоптоза при АККЛ. Системные АККЛ имеют два главных иммунофенотипа: Т- и О-клеточный. Большинство случаев имеют Т-клеточное происхождение, что подтверждается экспрессией одного или нескольких Т-клеточных антигенов. АККЛ О-клеточного фенотипа, возможно, принадлежит к Т-клеточному фенотипу, так как опухолевые клетки обычно экспрессируют цитотоксические молекулы: перфорин, гранзим В (granzyme) и Т1А-1.

Кожная анапластическая крупноклеточная лимфома характеризуется Т-фенотипом, но при этом отличается от системной формы, так как всегда АLK-негативна и обычно не экспрессирует ЕМА и цитотоксические молекулы.

По данным мировой литературы, в 60-70% случаев АККЛ наблюдается t(2;5)(q23q35), которая вызывает слияние гена ALK хромосомы 2 с геном NPM (нуклеофозмин) хромосомы 5. Следует отметить, что при периферических лимфопролиферациях в отличие от случаев, наблюдаемых при острых лейкозах, хромосомная транслокация, ведущая к появлению гибридных генов, редка. Дикий тип NPM-гена отвечает за кодирование филогенетически-консервированного и повсеместно проявляемого 37 kDa кислотного фосфобелглавных аргирофильных нуклеолярных (ядрышковых) белков (AgNOR ядрышек). Основной функцией NPM является перенос только что синтезированных белков в ядрышко. Для выполнения этой функции необходимы домен олигоомеризации N-концевой области и два ядерных сигнала в С-конечной области.

Область ядрышковых организаторов (ОЯОР) представляет собой участок вторичных перетяжек акроцентрических хромосом, где локализованы гены, кодирующие рибосомную РНК (рРНК), и формируется ядрышко непосредственно после деления клетки. С ОЯОР ассоциированы кислые негистоновые аргирофильные белки, регулирующие процесс синтеза рРНК и образование рибосом. Среди аргирофильных белков ОЯОР наиболее охарактеризованы РНК-полимераза I, белки С23 (нуклеолин) и В23 (нуклеофозмин).

Аргирофильные свойства ассоциированных с областью ядрышковых организаторов кислых негистоновых белков используются при выявлении ОЯОР при помощи нитрата серебра. Образующиеся при этом гранулы серебра являются маркерами ОЯОР. Показано, что нитратом серебра выявляются транскрипционно активные ОЯОР, и в этой связи степень аргирофилии ядрышковых структур может рассматриваться как цитохимический эквивалент функциональной активности рибосомных генов. Аргирофильные белки играют важную роль в регуляции клеточного цикла, определяя его продолжительность. При исследовании различных опухолей было выявлено повышение содержания в них белков области ядрышковых организаторов по мере прогрессирования злокачественного процесса. При этом, как было показано экспериментальными исследованиями, наблюдаемое повышение содержания белков ОЯОР происходит не в результате синтеза новых белков этого класса, а в результате усиленного синтеза белков ОЯОР — С23 и В23. Эти результаты позволили рассматривать активность области ядрышковых организаторов как один из критериев разграничения доброкачественных и злокачественных новообразований, выявления опухолей высокой и низкой степени злокачественности, определения прогноза. ALK-ген дикого типа кодирует крупный, гликилизированный, 200 kDa трансмембранный рецептор, ближе всего связанный с Ltk (лейкоцитотирозинкиназа), для которого соответствующий лиганд до сих пор не установлен и его обычная функция не определена. Местонахождение ALK-гена дикого типа в нормальных тканях ограничено поверхностной мембраной и цитоплазмой. Внутрицитоплазматический конец ALK несет тирозинкиназа каталитической области, которая физиологически активируется в результате гомодимеризации и связывания лигандов. Как следствие t (2;5) часть гена NPM, кодирующая аминоконечную область NPM (аминокислоты 1-116), сливается с частью гена ALK, кодирующей всю цитоплазматическую область белка ALK (последние 563 аминокислоты ALK) (рис. 1). В результате ген ALK попадает под контроль промотера NPM, что в свою очередь ведет к перманентному и повсеместному считыванию кода гибридного NPM-ALK-гена и получению 80 kDа рекомбинантного белка, обозначаемого NPM-ALK, или р80 (рис. 1).

Рис. 1. Молекулярная структура нуклеофозмина (NPM), киназы анапластической лимфомы и гибридных форм ALK. Рекомбинантный белок NPM-ALK способен образовывать гомодимеры (путем перекрещивания с NPM дикого типа). Образование гомодимеров ведет к конституционной активации каталитической области ALK путем имитации рецепторной димеризации и активации. In vitro трансфекция NPM-ALK в клеточные линии мышей/крыс ведет к формированию трансформированного фенотипа. Мало известно о сигнальных путях, по которым NPM-ALK оказывает онкогенное действие.

Фосфолипаза С-у, по всей видимости, является важной мишенью для NPM-ALK. На самом деле этот гибридный белок может связываться in vitro с областями Sh3 фосфолипазы С-у, что ведет к ее тирозинфосфорилированию и активации с последующей трансдукцией митогенных сигналов. NPM-ALK, вероятно, связан с фосфатидилинозитом (PI-3K) и производит конститутивную активацию путей антиапоптозной PI-3-киназы/ALK.

Менее ясной представляется роль взаимодействий NPM-ALK и других сигнальных молекул, а именно STAT5 и внутриклеточной областью CD30. In vitro NPM-ALK также связывается с Shc и субстратом инсулинового рецептора (insulin receptor substate 1, IRS-1), но эти взаимодействия не являются необходимыми для трансформации. Наконец, полученные противоречивые сведения, которые свидетельствуют о прямой подаче сигнала от NPM-ALK к соединительному белку GRB2, но в то же время у NPM-ALK не было найдено области, отвечающей за распознавание GRB2. Онкогенные свойства NPM-ALK in vivo подтверждаются экспериментальными данными, показывающими, что инфузия мышиных гемопоэтических клеток с трансфекцией NPM-ALK ведет к развитию лимфом. В то же время эти мышиные лимфомы имеют В-клеточное происхождение и, очевидно, отличаются от ALK-положительной лимфомы, развивающейся у людей, Т- и О-типа. Эти данные наводят на мысль о том, что активация одного и того же тирозинкиназасигнального пути может, с одной стороны, носить онкогенный характер в различных типах клеток, а с другой — свидетельствовать о взаимодействии NPM-ALK с широким диапазоном опухолевых молекул.

Рис. 2. Молекулярные механизмы взаимодействия NPM-ALK.

Для обнаружения NPM-ALK транслокаций в тканевых срезах существует несколько методов: PCR, метод in situ гибридизации, флюоресцентная in situ гибридизация (FISH). Так как при использовании метода PCR возможны артефакты и его применение требует высококачественного RNA, а FISH занимает много времени, иммуногистохимическое исследование, с практической точки зрения, является наиболее удобным и широко используемым методом, так как оно имеет строго определенные показания и легкое исполнение, недорого и дает быстрый результат.

Более того, этот метод позволяет использовать архивный, залитый в парафин материал, что дает возможность судить о природе меченых клеток и архитектонике тканей, а также определять молекулярные варианты АККЛ, которые несут гибридные гены, отличные от NPM-ALK, и не распознаются с помощью PCR.

Поликлональные и с недавних пор крайне специфические моноклональные антитела, направленные против фиксатор-резистентных эпитопов цитоплазматической области ALK, т.е. антитела ALK1  и ALKc, а также антитела против N-концевой области NPM, стали доступными для оптимального иммуногистохимического (ИГХ)-распознавания этих белков в парафиновых срезах. В отличие от копий NPM-ALK и ATIC-ALK, распознающихся с помощью PCR даже в низком содержании в обычных и реактивных лимфоидных тканях, белок ALK не экспрессируется в нормальных тканях, за исключением некоторых клеток нейрогенного происхождения.

Поэтому присутствие ALK-белка при проведении ИГХ-анализа в тканях, отличных от тканей мозга, является свидетельством аномального проявления ALK, обычно в форме связанного с t(2;5) химерного белка NPM-ALK. ИГХ-свидетельство молекулярной связи распознанного ALK c NPM находится в субклеточном распределении белка ALK, который в случае t(2;5) можно увидеть не только в цитоплазме, но и в ядре. Около 15-20% ALK-позитивной AKKA дают неожиданный для t(2;5) ИГХ-рисунок в виде ограниченной цитоплазмой экспрессии ALK и ограниченной ядром экспрессии NPM (N-конец) (рис. 3). На основании этих результатов были высказаны предположения о существовании молекулярных вариантов AKKA, при которых в качестве партнера при слиянии с ALK выступает ген, отличный от NPM, и это приводит к возникновению иных гибридных белков ALK.

Рис. 3. Экспрессия различных гибридных белков ALK. Возможность того, что отличные от NPM гены могут вступать в контакт с геном ALK и приводить к появлению отличных от NPM-ALK рекомбинантных ALK-белков, была высказана в связи с наличием цитогенетических данных, показывающих, что при AKKA ген ALK 2p23 присутствует в генетических аномалиях, отличных от t(2;5), например t(1;2) (q21; p23), t(2;3)(p23q21) и инверсии (p23;q35). Более того, исследования с моноклональными антителами, направленными против ALK и N-концевой части NPM, установили наличие иных ALK белков с 85, 97, 104 и 113 kDa в некоторых случаях анапластической крупноклеточной лимфомы с «аномальным» субклеточным распределением ALK NPM, выявленном при ИГХ-анализе. При использовании ALK1 и ALKc моноклональных антител экспрессия химерных ALK-белков (или вариантов NPM-ALK) обнаружена приблизительно в 60-70% АККЛ. В связи с этим был предложен термин «ALK-позитивная АККЛ», или «ALKoma». В литературе чаще встречается название ALK-позитивной АККЛ, так как термин «ALKoma» может быть отнесен и к опухолям другой природы, характеризующихся наличием ALK-белка и его вариантов (миофибробластические опухоли у детей, редко — рабдомиосаркома, нейробластома, ALK-позитивные диффузные B-крупноклеточные лимфомы). В настоящее время нет убедительного ответа на вопрос, представляется ли ALK-негативный вариант AККЛ отдельной нозологической единицей или является подвариантом неспецифицированной периферической T-клеточной лимфомы. Ответ на этот вопрос может быть дан в результате детального изучения молекулярных механизмов лимфомагенеза. Для клинической практики патолог должен диагностировать анапластическую крупноклеточную лимфому согласно строгим критериям, описанным выше, определяя в каждом случае основное — является ли опухоль ALK-позитивным или ALK-негативным вариантом, поскольку высказываются мнения о прогностическом значении этого феномена.

ALK-позитивная АККЛ представляет собой широкий морфологический спектр — от мелкоклеточного до крупноклеточного варианта АККЛ. Ядерная ALK-экспрессия — признак транслокации (2;5) — мелких и крупных клеток опухоли является доказательством, что они принадлежат к одному и тому же неопластическому клону. В некоторых случаях трансформация мелкоклеточного варианта в анапластической крупноклеточной лимфоме классического типа связана с приобретением дополнительной хромосомной аномалии, вовлекающей половую хромосому и хромосомы 6, 7, 9 и 15.

И.В. Поддубная, А.А. Семенова, Н.А. Пробатова
Page 2

1201

Одной из основных черт анапластической крупноклеточной лимфомы (АККЛ) является экспрессия CD30 (КМ)-молекулы. CD30 является 120 kDa трансмембранным цитокиновым рецептором из семейства рецепторов фактора некроза опухоли TNF), для которого был установлен лиганд (CD30L). Растворимая 85 kDa-форма CD30 вырабатывается мембраносвязанной молекулой путем протеолитического распада и может быть обнаружена в больших концентрациях в сыворотке крови пациентов. В крупных анапластических опухолевых клетках экспрессия CD30 ограничена мембраной, цитоплазмой и точечной (гранулярной) реакцией (dot-like) в области аппарата Гольджи. В мелкоклеточном варианте только крупные анапластические клетки (чаще сосредоточенные около сосудов) проявляют положительную экспрессию CD30, в то время как мелкие опухолевые клетки чаще являются слабопозитивными или негативными на CD30. Воспроизводимость диагноза АККЛ по морфологическим признакам составляет 46% и может быть увеличена до 85% при иммунном окрашивании на CD30, и, тем не менее, именно иммунные реакции на CD30 должны всегда проводиться параллельно с определением наличия прочих лимфоидных и нелимфоидных маркеров, потому что экспрессия CD30 не является специфической чертой только АККЛ и наблюдается в нормальных активированных клетках других В- и Т-клеточных лимфоидных и нелимфоидных опухолей, а также при негемопоэтических злокачественных заболеваниях, некоторых карциномах и новообразованиях из герминогенных клеток. Однако при анапластической крупноклеточной лимфоме  характерным является выраженная, интенсивная реакция на CD30 в подавляющем большинстве клеток. Другие неоплазмы могут также характеризо-ваться положительной СР30-реакцией, но обычно менее интенсивной и гетерогенной.

Положительная экспрессия эпителиально-мембранного антигена (ЕМА) наблюдается более чем в 50% случаев АККЛ, хотя в некоторых случаях экспрессия положительна только в части опухолевых клеток. Опыт многих работ показал, что экспрессия EMA при АККЛ чаще наблюдается у детей и молодых пациентов и сочетается с благоприятным прогнозом.

В настоящее время ИВХ-реакцию на определение экспрессии ALK-белка принято считать наиболее специфичным диагностическим методом. Современная усовершенствованная генная технология продемонстрировала аномальную экспрессию кластерина (clusterin) при системных АККЛ и ее отсутствие при кожных формах. Наличие кластерина не коррелирует с экспрессией АLК-белка, что характерно для экспрессии BCL-2 и с-Мус. Было установлено, что экспрессия BCL-2 возможна в основном при АLК-негативных вариантах, а ядерная экспрессия с-Мус, напротив, у АLК-позитивных анапластических крупноклеточных лимфом, что позволяет заключить, что наличие АLК-белка может оказывать влияние на индукцию апоптоза при АККЛ. Системные АККЛ имеют два главных иммунофенотипа: Т- и О-клеточный. Большинство случаев имеют Т-клеточное происхождение, что подтверждается экспрессией одного или нескольких Т-клеточных антигенов. АККЛ О-клеточного фенотипа, возможно, принадлежит к Т-клеточному фенотипу, так как опухолевые клетки обычно экспрессируют цитотоксические молекулы: перфорин, гранзим В (granzyme) и Т1А-1.

Кожная анапластическая крупноклеточная лимфома характеризуется Т-фенотипом, но при этом отличается от системной формы, так как всегда АLK-негативна и обычно не экспрессирует ЕМА и цитотоксические молекулы.

По данным мировой литературы, в 60-70% случаев АККЛ наблюдается t(2;5)(q23q35), которая вызывает слияние гена ALK хромосомы 2 с геном NPM (нуклеофозмин) хромосомы 5. Следует отметить, что при периферических лимфопролиферациях в отличие от случаев, наблюдаемых при острых лейкозах, хромосомная транслокация, ведущая к появлению гибридных генов, редка. Дикий тип NPM-гена отвечает за кодирование филогенетически-консервированного и повсеместно проявляемого 37 kDa кислотного фосфобелглавных аргирофильных нуклеолярных (ядрышковых) белков (AgNOR ядрышек). Основной функцией NPM является перенос только что синтезированных белков в ядрышко. Для выполнения этой функции необходимы домен олигоомеризации N-концевой области и два ядерных сигнала в С-конечной области.

Область ядрышковых организаторов (ОЯОР) представляет собой участок вторичных перетяжек акроцентрических хромосом, где локализованы гены, кодирующие рибосомную РНК (рРНК), и формируется ядрышко непосредственно после деления клетки. С ОЯОР ассоциированы кислые негистоновые аргирофильные белки, регулирующие процесс синтеза рРНК и образование рибосом. Среди аргирофильных белков ОЯОР наиболее охарактеризованы РНК-полимераза I, белки С23 (нуклеолин) и В23 (нуклеофозмин).

Аргирофильные свойства ассоциированных с областью ядрышковых организаторов кислых негистоновых белков используются при выявлении ОЯОР при помощи нитрата серебра. Образующиеся при этом гранулы серебра являются маркерами ОЯОР. Показано, что нитратом серебра выявляются транскрипционно активные ОЯОР, и в этой связи степень аргирофилии ядрышковых структур может рассматриваться как цитохимический эквивалент функциональной активности рибосомных генов. Аргирофильные белки играют важную роль в регуляции клеточного цикла, определяя его продолжительность. При исследовании различных опухолей было выявлено повышение содержания в них белков области ядрышковых организаторов по мере прогрессирования злокачественного процесса. При этом, как было показано экспериментальными исследованиями, наблюдаемое повышение содержания белков ОЯОР происходит не в результате синтеза новых белков этого класса, а в результате усиленного синтеза белков ОЯОР — С23 и В23. Эти результаты позволили рассматривать активность области ядрышковых организаторов как один из критериев разграничения доброкачественных и злокачественных новообразований, выявления опухолей высокой и низкой степени злокачественности, определения прогноза. ALK-ген дикого типа кодирует крупный, гликилизированный, 200 kDa трансмембранный рецептор, ближе всего связанный с Ltk (лейкоцитотирозинкиназа), для которого соответствующий лиганд до сих пор не установлен и его обычная функция не определена. Местонахождение ALK-гена дикого типа в нормальных тканях ограничено поверхностной мембраной и цитоплазмой. Внутрицитоплазматический конец ALK несет тирозинкиназа каталитической области, которая физиологически активируется в результате гомодимеризации и связывания лигандов. Как следствие t (2;5) часть гена NPM, кодирующая аминоконечную область NPM (аминокислоты 1-116), сливается с частью гена ALK, кодирующей всю цитоплазматическую область белка ALK (последние 563 аминокислоты ALK) (рис. 1). В результате ген ALK попадает под контроль промотера NPM, что в свою очередь ведет к перманентному и повсеместному считыванию кода гибридного NPM-ALK-гена и получению 80 kDа рекомбинантного белка, обозначаемого NPM-ALK, или р80 (рис. 1).

Рис. 1. Молекулярная структура нуклеофозмина (NPM), киназы анапластической лимфомы и гибридных форм ALK. Рекомбинантный белок NPM-ALK способен образовывать гомодимеры (путем перекрещивания с NPM дикого типа). Образование гомодимеров ведет к конституционной активации каталитической области ALK путем имитации рецепторной димеризации и активации. In vitro трансфекция NPM-ALK в клеточные линии мышей/крыс ведет к формированию трансформированного фенотипа. Мало известно о сигнальных путях, по которым NPM-ALK оказывает онкогенное действие.

Фосфолипаза С-у, по всей видимости, является важной мишенью для NPM-ALK. На самом деле этот гибридный белок может связываться in vitro с областями Sh3 фосфолипазы С-у, что ведет к ее тирозинфосфорилированию и активации с последующей трансдукцией митогенных сигналов. NPM-ALK, вероятно, связан с фосфатидилинозитом (PI-3K) и производит конститутивную активацию путей антиапоптозной PI-3-киназы/ALK.

Менее ясной представляется роль взаимодействий NPM-ALK и других сигнальных молекул, а именно STAT5 и внутриклеточной областью CD30. In vitro NPM-ALK также связывается с Shc и субстратом инсулинового рецептора (insulin receptor substate 1, IRS-1), но эти взаимодействия не являются необходимыми для трансформации. Наконец, полученные противоречивые сведения, которые свидетельствуют о прямой подаче сигнала от NPM-ALK к соединительному белку GRB2, но в то же время у NPM-ALK не было найдено области, отвечающей за распознавание GRB2. Онкогенные свойства NPM-ALK in vivo подтверждаются экспериментальными данными, показывающими, что инфузия мышиных гемопоэтических клеток с трансфекцией NPM-ALK ведет к развитию лимфом. В то же время эти мышиные лимфомы имеют В-клеточное происхождение и, очевидно, отличаются от ALK-положительной лимфомы, развивающейся у людей, Т- и О-типа. Эти данные наводят на мысль о том, что активация одного и того же тирозинкиназасигнального пути может, с одной стороны, носить онкогенный характер в различных типах клеток, а с другой — свидетельствовать о взаимодействии NPM-ALK с широким диапазоном опухолевых молекул.

Рис. 2. Молекулярные механизмы взаимодействия NPM-ALK.

Для обнаружения NPM-ALK транслокаций в тканевых срезах существует несколько методов: PCR, метод in situ гибридизации, флюоресцентная in situ гибридизация (FISH). Так как при использовании метода PCR возможны артефакты и его применение требует высококачественного RNA, а FISH занимает много времени, иммуногистохимическое исследование, с практической точки зрения, является наиболее удобным и широко используемым методом, так как оно имеет строго определенные показания и легкое исполнение, недорого и дает быстрый результат.

Более того, этот метод позволяет использовать архивный, залитый в парафин материал, что дает возможность судить о природе меченых клеток и архитектонике тканей, а также определять молекулярные варианты АККЛ, которые несут гибридные гены, отличные от NPM-ALK, и не распознаются с помощью PCR.

Поликлональные и с недавних пор крайне специфические моноклональные антитела, направленные против фиксатор-резистентных эпитопов цитоплазматической области ALK, т.е. антитела ALK1  и ALKc, а также антитела против N-концевой области NPM, стали доступными для оптимального иммуногистохимического (ИГХ)-распознавания этих белков в парафиновых срезах. В отличие от копий NPM-ALK и ATIC-ALK, распознающихся с помощью PCR даже в низком содержании в обычных и реактивных лимфоидных тканях, белок ALK не экспрессируется в нормальных тканях, за исключением некоторых клеток нейрогенного происхождения.

Поэтому присутствие ALK-белка при проведении ИГХ-анализа в тканях, отличных от тканей мозга, является свидетельством аномального проявления ALK, обычно в форме связанного с t(2;5) химерного белка NPM-ALK. ИГХ-свидетельство молекулярной связи распознанного ALK c NPM находится в субклеточном распределении белка ALK, который в случае t(2;5) можно увидеть не только в цитоплазме, но и в ядре. Около 15-20% ALK-позитивной AKKA дают неожиданный для t(2;5) ИГХ-рисунок в виде ограниченной цитоплазмой экспрессии ALK и ограниченной ядром экспрессии NPM (N-конец) (рис. 3). На основании этих результатов были высказаны предположения о существовании молекулярных вариантов AKKA, при которых в качестве партнера при слиянии с ALK выступает ген, отличный от NPM, и это приводит к возникновению иных гибридных белков ALK.

Рис. 3. Экспрессия различных гибридных белков ALK. Возможность того, что отличные от NPM гены могут вступать в контакт с геном ALK и приводить к появлению отличных от NPM-ALK рекомбинантных ALK-белков, была высказана в связи с наличием цитогенетических данных, показывающих, что при AKKA ген ALK 2p23 присутствует в генетических аномалиях, отличных от t(2;5), например t(1;2) (q21; p23), t(2;3)(p23q21) и инверсии (p23;q35). Более того, исследования с моноклональными антителами, направленными против ALK и N-концевой части NPM, установили наличие иных ALK белков с 85, 97, 104 и 113 kDa в некоторых случаях анапластической крупноклеточной лимфомы с «аномальным» субклеточным распределением ALK NPM, выявленном при ИГХ-анализе. При использовании ALK1 и ALKc моноклональных антител экспрессия химерных ALK-белков (или вариантов NPM-ALK) обнаружена приблизительно в 60-70% АККЛ. В связи с этим был предложен термин «ALK-позитивная АККЛ», или «ALKoma». В литературе чаще встречается название ALK-позитивной АККЛ, так как термин «ALKoma» может быть отнесен и к опухолям другой природы, характеризующихся наличием ALK-белка и его вариантов (миофибробластические опухоли у детей, редко — рабдомиосаркома, нейробластома, ALK-позитивные диффузные B-крупноклеточные лимфомы). В настоящее время нет убедительного ответа на вопрос, представляется ли ALK-негативный вариант AККЛ отдельной нозологической единицей или является подвариантом неспецифицированной периферической T-клеточной лимфомы. Ответ на этот вопрос может быть дан в результате детального изучения молекулярных механизмов лимфомагенеза. Для клинической практики патолог должен диагностировать анапластическую крупноклеточную лимфому согласно строгим критериям, описанным выше, определяя в каждом случае основное — является ли опухоль ALK-позитивным или ALK-негативным вариантом, поскольку высказываются мнения о прогностическом значении этого феномена.

ALK-позитивная АККЛ представляет собой широкий морфологический спектр — от мелкоклеточного до крупноклеточного варианта АККЛ. Ядерная ALK-экспрессия — признак транслокации (2;5) — мелких и крупных клеток опухоли является доказательством, что они принадлежат к одному и тому же неопластическому клону. В некоторых случаях трансформация мелкоклеточного варианта в анапластической крупноклеточной лимфоме классического типа связана с приобретением дополнительной хромосомной аномалии, вовлекающей половую хромосому и хромосомы 6, 7, 9 и 15.

И.В. Поддубная, А.А. Семенова, Н.А. Пробатова
Page 3

1201

Одной из основных черт анапластической крупноклеточной лимфомы (АККЛ) является экспрессия CD30 (КМ)-молекулы. CD30 является 120 kDa трансмембранным цитокиновым рецептором из семейства рецепторов фактора некроза опухоли TNF), для которого был установлен лиганд (CD30L). Растворимая 85 kDa-форма CD30 вырабатывается мембраносвязанной молекулой путем протеолитического распада и может быть обнаружена в больших концентрациях в сыворотке крови пациентов. В крупных анапластических опухолевых клетках экспрессия CD30 ограничена мембраной, цитоплазмой и точечной (гранулярной) реакцией (dot-like) в области аппарата Гольджи. В мелкоклеточном варианте только крупные анапластические клетки (чаще сосредоточенные около сосудов) проявляют положительную экспрессию CD30, в то время как мелкие опухолевые клетки чаще являются слабопозитивными или негативными на CD30. Воспроизводимость диагноза АККЛ по морфологическим признакам составляет 46% и может быть увеличена до 85% при иммунном окрашивании на CD30, и, тем не менее, именно иммунные реакции на CD30 должны всегда проводиться параллельно с определением наличия прочих лимфоидных и нелимфоидных маркеров, потому что экспрессия CD30 не является специфической чертой только АККЛ и наблюдается в нормальных активированных клетках других В- и Т-клеточных лимфоидных и нелимфоидных опухолей, а также при негемопоэтических злокачественных заболеваниях, некоторых карциномах и новообразованиях из герминогенных клеток. Однако при анапластической крупноклеточной лимфоме  характерным является выраженная, интенсивная реакция на CD30 в подавляющем большинстве клеток. Другие неоплазмы могут также характеризо-ваться положительной СР30-реакцией, но обычно менее интенсивной и гетерогенной.

Положительная экспрессия эпителиально-мембранного антигена (ЕМА) наблюдается более чем в 50% случаев АККЛ, хотя в некоторых случаях экспрессия положительна только в части опухолевых клеток. Опыт многих работ показал, что экспрессия EMA при АККЛ чаще наблюдается у детей и молодых пациентов и сочетается с благоприятным прогнозом.

В настоящее время ИВХ-реакцию на определение экспрессии ALK-белка принято считать наиболее специфичным диагностическим методом. Современная усовершенствованная генная технология продемонстрировала аномальную экспрессию кластерина (clusterin) при системных АККЛ и ее отсутствие при кожных формах. Наличие кластерина не коррелирует с экспрессией АLК-белка, что характерно для экспрессии BCL-2 и с-Мус. Было установлено, что экспрессия BCL-2 возможна в основном при АLК-негативных вариантах, а ядерная экспрессия с-Мус, напротив, у АLК-позитивных анапластических крупноклеточных лимфом, что позволяет заключить, что наличие АLК-белка может оказывать влияние на индукцию апоптоза при АККЛ. Системные АККЛ имеют два главных иммунофенотипа: Т- и О-клеточный. Большинство случаев имеют Т-клеточное происхождение, что подтверждается экспрессией одного или нескольких Т-клеточных антигенов. АККЛ О-клеточного фенотипа, возможно, принадлежит к Т-клеточному фенотипу, так как опухолевые клетки обычно экспрессируют цитотоксические молекулы: перфорин, гранзим В (granzyme) и Т1А-1.

Кожная анапластическая крупноклеточная лимфома характеризуется Т-фенотипом, но при этом отличается от системной формы, так как всегда АLK-негативна и обычно не экспрессирует ЕМА и цитотоксические молекулы.

По данным мировой литературы, в 60-70% случаев АККЛ наблюдается t(2;5)(q23q35), которая вызывает слияние гена ALK хромосомы 2 с геном NPM (нуклеофозмин) хромосомы 5. Следует отметить, что при периферических лимфопролиферациях в отличие от случаев, наблюдаемых при острых лейкозах, хромосомная транслокация, ведущая к появлению гибридных генов, редка. Дикий тип NPM-гена отвечает за кодирование филогенетически-консервированного и повсеместно проявляемого 37 kDa кислотного фосфобелглавных аргирофильных нуклеолярных (ядрышковых) белков (AgNOR ядрышек). Основной функцией NPM является перенос только что синтезированных белков в ядрышко. Для выполнения этой функции необходимы домен олигоомеризации N-концевой области и два ядерных сигнала в С-конечной области.

Область ядрышковых организаторов (ОЯОР) представляет собой участок вторичных перетяжек акроцентрических хромосом, где локализованы гены, кодирующие рибосомную РНК (рРНК), и формируется ядрышко непосредственно после деления клетки. С ОЯОР ассоциированы кислые негистоновые аргирофильные белки, регулирующие процесс синтеза рРНК и образование рибосом. Среди аргирофильных белков ОЯОР наиболее охарактеризованы РНК-полимераза I, белки С23 (нуклеолин) и В23 (нуклеофозмин).

Аргирофильные свойства ассоциированных с областью ядрышковых организаторов кислых негистоновых белков используются при выявлении ОЯОР при помощи нитрата серебра. Образующиеся при этом гранулы серебра являются маркерами ОЯОР. Показано, что нитратом серебра выявляются транскрипционно активные ОЯОР, и в этой связи степень аргирофилии ядрышковых структур может рассматриваться как цитохимический эквивалент функциональной активности рибосомных генов. Аргирофильные белки играют важную роль в регуляции клеточного цикла, определяя его продолжительность. При исследовании различных опухолей было выявлено повышение содержания в них белков области ядрышковых организаторов по мере прогрессирования злокачественного процесса. При этом, как было показано экспериментальными исследованиями, наблюдаемое повышение содержания белков ОЯОР происходит не в результате синтеза новых белков этого класса, а в результате усиленного синтеза белков ОЯОР — С23 и В23. Эти результаты позволили рассматривать активность области ядрышковых организаторов как один из критериев разграничения доброкачественных и злокачественных новообразований, выявления опухолей высокой и низкой степени злокачественности, определения прогноза. ALK-ген дикого типа кодирует крупный, гликилизированный, 200 kDa трансмембранный рецептор, ближе всего связанный с Ltk (лейкоцитотирозинкиназа), для которого соответствующий лиганд до сих пор не установлен и его обычная функция не определена. Местонахождение ALK-гена дикого типа в нормальных тканях ограничено поверхностной мембраной и цитоплазмой. Внутрицитоплазматический конец ALK несет тирозинкиназа каталитической области, которая физиологически активируется в результате гомодимеризации и связывания лигандов. Как следствие t (2;5) часть гена NPM, кодирующая аминоконечную область NPM (аминокислоты 1-116), сливается с частью гена ALK, кодирующей всю цитоплазматическую область белка ALK (последние 563 аминокислоты ALK) (рис. 1). В результате ген ALK попадает под контроль промотера NPM, что в свою очередь ведет к перманентному и повсеместному считыванию кода гибридного NPM-ALK-гена и получению 80 kDа рекомбинантного белка, обозначаемого NPM-ALK, или р80 (рис. 1).

Рис. 1. Молекулярная структура нуклеофозмина (NPM), киназы анапластической лимфомы и гибридных форм ALK. Рекомбинантный белок NPM-ALK способен образовывать гомодимеры (путем перекрещивания с NPM дикого типа). Образование гомодимеров ведет к конституционной активации каталитической области ALK путем имитации рецепторной димеризации и активации. In vitro трансфекция NPM-ALK в клеточные линии мышей/крыс ведет к формированию трансформированного фенотипа. Мало известно о сигнальных путях, по которым NPM-ALK оказывает онкогенное действие.

Фосфолипаза С-у, по всей видимости, является важной мишенью для NPM-ALK. На самом деле этот гибридный белок может связываться in vitro с областями Sh3 фосфолипазы С-у, что ведет к ее тирозинфосфорилированию и активации с последующей трансдукцией митогенных сигналов. NPM-ALK, вероятно, связан с фосфатидилинозитом (PI-3K) и производит конститутивную активацию путей антиапоптозной PI-3-киназы/ALK.

Менее ясной представляется роль взаимодействий NPM-ALK и других сигнальных молекул, а именно STAT5 и внутриклеточной областью CD30. In vitro NPM-ALK также связывается с Shc и субстратом инсулинового рецептора (insulin receptor substate 1, IRS-1), но эти взаимодействия не являются необходимыми для трансформации. Наконец, полученные противоречивые сведения, которые свидетельствуют о прямой подаче сигнала от NPM-ALK к соединительному белку GRB2, но в то же время у NPM-ALK не было найдено области, отвечающей за распознавание GRB2. Онкогенные свойства NPM-ALK in vivo подтверждаются экспериментальными данными, показывающими, что инфузия мышиных гемопоэтических клеток с трансфекцией NPM-ALK ведет к развитию лимфом. В то же время эти мышиные лимфомы имеют В-клеточное происхождение и, очевидно, отличаются от ALK-положительной лимфомы, развивающейся у людей, Т- и О-типа. Эти данные наводят на мысль о том, что активация одного и того же тирозинкиназасигнального пути может, с одной стороны, носить онкогенный характер в различных типах клеток, а с другой — свидетельствовать о взаимодействии NPM-ALK с широким диапазоном опухолевых молекул.

Рис. 2. Молекулярные механизмы взаимодействия NPM-ALK.

Для обнаружения NPM-ALK транслокаций в тканевых срезах существует несколько методов: PCR, метод in situ гибридизации, флюоресцентная in situ гибридизация (FISH). Так как при использовании метода PCR возможны артефакты и его применение требует высококачественного RNA, а FISH занимает много времени, иммуногистохимическое исследование, с практической точки зрения, является наиболее удобным и широко используемым методом, так как оно имеет строго определенные показания и легкое исполнение, недорого и дает быстрый результат.

Более того, этот метод позволяет использовать архивный, залитый в парафин материал, что дает возможность судить о природе меченых клеток и архитектонике тканей, а также определять молекулярные варианты АККЛ, которые несут гибридные гены, отличные от NPM-ALK, и не распознаются с помощью PCR.

Поликлональные и с недавних пор крайне специфические моноклональные антитела, направленные против фиксатор-резистентных эпитопов цитоплазматической области ALK, т.е. антитела ALK1  и ALKc, а также антитела против N-концевой области NPM, стали доступными для оптимального иммуногистохимического (ИГХ)-распознавания этих белков в парафиновых срезах. В отличие от копий NPM-ALK и ATIC-ALK, распознающихся с помощью PCR даже в низком содержании в обычных и реактивных лимфоидных тканях, белок ALK не экспрессируется в нормальных тканях, за исключением некоторых клеток нейрогенного происхождения.

Поэтому присутствие ALK-белка при проведении ИГХ-анализа в тканях, отличных от тканей мозга, является свидетельством аномального проявления ALK, обычно в форме связанного с t(2;5) химерного белка NPM-ALK. ИГХ-свидетельство молекулярной связи распознанного ALK c NPM находится в субклеточном распределении белка ALK, который в случае t(2;5) можно увидеть не только в цитоплазме, но и в ядре. Около 15-20% ALK-позитивной AKKA дают неожиданный для t(2;5) ИГХ-рисунок в виде ограниченной цитоплазмой экспрессии ALK и ограниченной ядром экспрессии NPM (N-конец) (рис. 3). На основании этих результатов были высказаны предположения о существовании молекулярных вариантов AKKA, при которых в качестве партнера при слиянии с ALK выступает ген, отличный от NPM, и это приводит к возникновению иных гибридных белков ALK.

Рис. 3. Экспрессия различных гибридных белков ALK. Возможность того, что отличные от NPM гены могут вступать в контакт с геном ALK и приводить к появлению отличных от NPM-ALK рекомбинантных ALK-белков, была высказана в связи с наличием цитогенетических данных, показывающих, что при AKKA ген ALK 2p23 присутствует в генетических аномалиях, отличных от t(2;5), например t(1;2) (q21; p23), t(2;3)(p23q21) и инверсии (p23;q35). Более того, исследования с моноклональными антителами, направленными против ALK и N-концевой части NPM, установили наличие иных ALK белков с 85, 97, 104 и 113 kDa в некоторых случаях анапластической крупноклеточной лимфомы с «аномальным» субклеточным распределением ALK NPM, выявленном при ИГХ-анализе. При использовании ALK1 и ALKc моноклональных антител экспрессия химерных ALK-белков (или вариантов NPM-ALK) обнаружена приблизительно в 60-70% АККЛ. В связи с этим был предложен термин «ALK-позитивная АККЛ», или «ALKoma». В литературе чаще встречается название ALK-позитивной АККЛ, так как термин «ALKoma» может быть отнесен и к опухолям другой природы, характеризующихся наличием ALK-белка и его вариантов (миофибробластические опухоли у детей, редко — рабдомиосаркома, нейробластома, ALK-позитивные диффузные B-крупноклеточные лимфомы). В настоящее время нет убедительного ответа на вопрос, представляется ли ALK-негативный вариант AККЛ отдельной нозологической единицей или является подвариантом неспецифицированной периферической T-клеточной лимфомы. Ответ на этот вопрос может быть дан в результате детального изучения молекулярных механизмов лимфомагенеза. Для клинической практики патолог должен диагностировать анапластическую крупноклеточную лимфому согласно строгим критериям, описанным выше, определяя в каждом случае основное — является ли опухоль ALK-позитивным или ALK-негативным вариантом, поскольку высказываются мнения о прогностическом значении этого феномена.

ALK-позитивная АККЛ представляет собой широкий морфологический спектр — от мелкоклеточного до крупноклеточного варианта АККЛ. Ядерная ALK-экспрессия — признак транслокации (2;5) — мелких и крупных клеток опухоли является доказательством, что они принадлежат к одному и тому же неопластическому клону. В некоторых случаях трансформация мелкоклеточного варианта в анапластической крупноклеточной лимфоме классического типа связана с приобретением дополнительной хромосомной аномалии, вовлекающей половую хромосому и хромосомы 6, 7, 9 и 15.

И.В. Поддубная, А.А. Семенова, Н.А. Пробатова
Page 4

1201

Одной из основных черт анапластической крупноклеточной лимфомы (АККЛ) является экспрессия CD30 (КМ)-молекулы. CD30 является 120 kDa трансмембранным цитокиновым рецептором из семейства рецепторов фактора некроза опухоли TNF), для которого был установлен лиганд (CD30L). Растворимая 85 kDa-форма CD30 вырабатывается мембраносвязанной молекулой путем протеолитического распада и может быть обнаружена в больших концентрациях в сыворотке крови пациентов. В крупных анапластических опухолевых клетках экспрессия CD30 ограничена мембраной, цитоплазмой и точечной (гранулярной) реакцией (dot-like) в области аппарата Гольджи. В мелкоклеточном варианте только крупные анапластические клетки (чаще сосредоточенные около сосудов) проявляют положительную экспрессию CD30, в то время как мелкие опухолевые клетки чаще являются слабопозитивными или негативными на CD30. Воспроизводимость диагноза АККЛ по морфологическим признакам составляет 46% и может быть увеличена до 85% при иммунном окрашивании на CD30, и, тем не менее, именно иммунные реакции на CD30 должны всегда проводиться параллельно с определением наличия прочих лимфоидных и нелимфоидных маркеров, потому что экспрессия CD30 не является специфической чертой только АККЛ и наблюдается в нормальных активированных клетках других В- и Т-клеточных лимфоидных и нелимфоидных опухолей, а также при негемопоэтических злокачественных заболеваниях, некоторых карциномах и новообразованиях из герминогенных клеток. Однако при анапластической крупноклеточной лимфоме  характерным является выраженная, интенсивная реакция на CD30 в подавляющем большинстве клеток. Другие неоплазмы могут также характеризо-ваться положительной СР30-реакцией, но обычно менее интенсивной и гетерогенной.

Положительная экспрессия эпителиально-мембранного антигена (ЕМА) наблюдается более чем в 50% случаев АККЛ, хотя в некоторых случаях экспрессия положительна только в части опухолевых клеток. Опыт многих работ показал, что экспрессия EMA при АККЛ чаще наблюдается у детей и молодых пациентов и сочетается с благоприятным прогнозом.

В настоящее время ИВХ-реакцию на определение экспрессии ALK-белка принято считать наиболее специфичным диагностическим методом. Современная усовершенствованная генная технология продемонстрировала аномальную экспрессию кластерина (clusterin) при системных АККЛ и ее отсутствие при кожных формах. Наличие кластерина не коррелирует с экспрессией АLК-белка, что характерно для экспрессии BCL-2 и с-Мус. Было установлено, что экспрессия BCL-2 возможна в основном при АLК-негативных вариантах, а ядерная экспрессия с-Мус, напротив, у АLК-позитивных анапластических крупноклеточных лимфом, что позволяет заключить, что наличие АLК-белка может оказывать влияние на индукцию апоптоза при АККЛ. Системные АККЛ имеют два главных иммунофенотипа: Т- и О-клеточный. Большинство случаев имеют Т-клеточное происхождение, что подтверждается экспрессией одного или нескольких Т-клеточных антигенов. АККЛ О-клеточного фенотипа, возможно, принадлежит к Т-клеточному фенотипу, так как опухолевые клетки обычно экспрессируют цитотоксические молекулы: перфорин, гранзим В (granzyme) и Т1А-1.

Кожная анапластическая крупноклеточная лимфома характеризуется Т-фенотипом, но при этом отличается от системной формы, так как всегда АLK-негативна и обычно не экспрессирует ЕМА и цитотоксические молекулы.

По данным мировой литературы, в 60-70% случаев АККЛ наблюдается t(2;5)(q23q35), которая вызывает слияние гена ALK хромосомы 2 с геном NPM (нуклеофозмин) хромосомы 5. Следует отметить, что при периферических лимфопролиферациях в отличие от случаев, наблюдаемых при острых лейкозах, хромосомная транслокация, ведущая к появлению гибридных генов, редка. Дикий тип NPM-гена отвечает за кодирование филогенетически-консервированного и повсеместно проявляемого 37 kDa кислотного фосфобелглавных аргирофильных нуклеолярных (ядрышковых) белков (AgNOR ядрышек). Основной функцией NPM является перенос только что синтезированных белков в ядрышко. Для выполнения этой функции необходимы домен олигоомеризации N-концевой области и два ядерных сигнала в С-конечной области.

Область ядрышковых организаторов (ОЯОР) представляет собой участок вторичных перетяжек акроцентрических хромосом, где локализованы гены, кодирующие рибосомную РНК (рРНК), и формируется ядрышко непосредственно после деления клетки. С ОЯОР ассоциированы кислые негистоновые аргирофильные белки, регулирующие процесс синтеза рРНК и образование рибосом. Среди аргирофильных белков ОЯОР наиболее охарактеризованы РНК-полимераза I, белки С23 (нуклеолин) и В23 (нуклеофозмин).

Аргирофильные свойства ассоциированных с областью ядрышковых организаторов кислых негистоновых белков используются при выявлении ОЯОР при помощи нитрата серебра. Образующиеся при этом гранулы серебра являются маркерами ОЯОР. Показано, что нитратом серебра выявляются транскрипционно активные ОЯОР, и в этой связи степень аргирофилии ядрышковых структур может рассматриваться как цитохимический эквивалент функциональной активности рибосомных генов. Аргирофильные белки играют важную роль в регуляции клеточного цикла, определяя его продолжительность. При исследовании различных опухолей было выявлено повышение содержания в них белков области ядрышковых организаторов по мере прогрессирования злокачественного процесса. При этом, как было показано экспериментальными исследованиями, наблюдаемое повышение содержания белков ОЯОР происходит не в результате синтеза новых белков этого класса, а в результате усиленного синтеза белков ОЯОР — С23 и В23. Эти результаты позволили рассматривать активность области ядрышковых организаторов как один из критериев разграничения доброкачественных и злокачественных новообразований, выявления опухолей высокой и низкой степени злокачественности, определения прогноза. ALK-ген дикого типа кодирует крупный, гликилизированный, 200 kDa трансмембранный рецептор, ближе всего связанный с Ltk (лейкоцитотирозинкиназа), для которого соответствующий лиганд до сих пор не установлен и его обычная функция не определена. Местонахождение ALK-гена дикого типа в нормальных тканях ограничено поверхностной мембраной и цитоплазмой. Внутрицитоплазматический конец ALK несет тирозинкиназа каталитической области, которая физиологически активируется в результате гомодимеризации и связывания лигандов. Как следствие t (2;5) часть гена NPM, кодирующая аминоконечную область NPM (аминокислоты 1-116), сливается с частью гена ALK, кодирующей всю цитоплазматическую область белка ALK (последние 563 аминокислоты ALK) (рис. 1). В результате ген ALK попадает под контроль промотера NPM, что в свою очередь ведет к перманентному и повсеместному считыванию кода гибридного NPM-ALK-гена и получению 80 kDа рекомбинантного белка, обозначаемого NPM-ALK, или р80 (рис. 1).

Рис. 1. Молекулярная структура нуклеофозмина (NPM), киназы анапластической лимфомы и гибридных форм ALK. Рекомбинантный белок NPM-ALK способен образовывать гомодимеры (путем перекрещивания с NPM дикого типа). Образование гомодимеров ведет к конституционной активации каталитической области ALK путем имитации рецепторной димеризации и активации. In vitro трансфекция NPM-ALK в клеточные линии мышей/крыс ведет к формированию трансформированного фенотипа. Мало известно о сигнальных путях, по которым NPM-ALK оказывает онкогенное действие.

Фосфолипаза С-у, по всей видимости, является важной мишенью для NPM-ALK. На самом деле этот гибридный белок может связываться in vitro с областями Sh3 фосфолипазы С-у, что ведет к ее тирозинфосфорилированию и активации с последующей трансдукцией митогенных сигналов. NPM-ALK, вероятно, связан с фосфатидилинозитом (PI-3K) и производит конститутивную активацию путей антиапоптозной PI-3-киназы/ALK.

Менее ясной представляется роль взаимодействий NPM-ALK и других сигнальных молекул, а именно STAT5 и внутриклеточной областью CD30. In vitro NPM-ALK также связывается с Shc и субстратом инсулинового рецептора (insulin receptor substate 1, IRS-1), но эти взаимодействия не являются необходимыми для трансформации. Наконец, полученные противоречивые сведения, которые свидетельствуют о прямой подаче сигнала от NPM-ALK к соединительному белку GRB2, но в то же время у NPM-ALK не было найдено области, отвечающей за распознавание GRB2. Онкогенные свойства NPM-ALK in vivo подтверждаются экспериментальными данными, показывающими, что инфузия мышиных гемопоэтических клеток с трансфекцией NPM-ALK ведет к развитию лимфом. В то же время эти мышиные лимфомы имеют В-клеточное происхождение и, очевидно, отличаются от ALK-положительной лимфомы, развивающейся у людей, Т- и О-типа. Эти данные наводят на мысль о том, что активация одного и того же тирозинкиназасигнального пути может, с одной стороны, носить онкогенный характер в различных типах клеток, а с другой — свидетельствовать о взаимодействии NPM-ALK с широким диапазоном опухолевых молекул.

Рис. 2. Молекулярные механизмы взаимодействия NPM-ALK.

Для обнаружения NPM-ALK транслокаций в тканевых срезах существует несколько методов: PCR, метод in situ гибридизации, флюоресцентная in situ гибридизация (FISH). Так как при использовании метода PCR возможны артефакты и его применение требует высококачественного RNA, а FISH занимает много времени, иммуногистохимическое исследование, с практической точки зрения, является наиболее удобным и широко используемым методом, так как оно имеет строго определенные показания и легкое исполнение, недорого и дает быстрый результат.

Более того, этот метод позволяет использовать архивный, залитый в парафин материал, что дает возможность судить о природе меченых клеток и архитектонике тканей, а также определять молекулярные варианты АККЛ, которые несут гибридные гены, отличные от NPM-ALK, и не распознаются с помощью PCR.

Поликлональные и с недавних пор крайне специфические моноклональные антитела, направленные против фиксатор-резистентных эпитопов цитоплазматической области ALK, т.е. антитела ALK1  и ALKc, а также антитела против N-концевой области NPM, стали доступными для оптимального иммуногистохимического (ИГХ)-распознавания этих белков в парафиновых срезах. В отличие от копий NPM-ALK и ATIC-ALK, распознающихся с помощью PCR даже в низком содержании в обычных и реактивных лимфоидных тканях, белок ALK не экспрессируется в нормальных тканях, за исключением некоторых клеток нейрогенного происхождения.

Поэтому присутствие ALK-белка при проведении ИГХ-анализа в тканях, отличных от тканей мозга, является свидетельством аномального проявления ALK, обычно в форме связанного с t(2;5) химерного белка NPM-ALK. ИГХ-свидетельство молекулярной связи распознанного ALK c NPM находится в субклеточном распределении белка ALK, который в случае t(2;5) можно увидеть не только в цитоплазме, но и в ядре. Около 15-20% ALK-позитивной AKKA дают неожиданный для t(2;5) ИГХ-рисунок в виде ограниченной цитоплазмой экспрессии ALK и ограниченной ядром экспрессии NPM (N-конец) (рис. 3). На основании этих результатов были высказаны предположения о существовании молекулярных вариантов AKKA, при которых в качестве партнера при слиянии с ALK выступает ген, отличный от NPM, и это приводит к возникновению иных гибридных белков ALK.

Рис. 3. Экспрессия различных гибридных белков ALK. Возможность того, что отличные от NPM гены могут вступать в контакт с геном ALK и приводить к появлению отличных от NPM-ALK рекомбинантных ALK-белков, была высказана в связи с наличием цитогенетических данных, показывающих, что при AKKA ген ALK 2p23 присутствует в генетических аномалиях, отличных от t(2;5), например t(1;2) (q21; p23), t(2;3)(p23q21) и инверсии (p23;q35). Более того, исследования с моноклональными антителами, направленными против ALK и N-концевой части NPM, установили наличие иных ALK белков с 85, 97, 104 и 113 kDa в некоторых случаях анапластической крупноклеточной лимфомы с «аномальным» субклеточным распределением ALK NPM, выявленном при ИГХ-анализе. При использовании ALK1 и ALKc моноклональных антител экспрессия химерных ALK-белков (или вариантов NPM-ALK) обнаружена приблизительно в 60-70% АККЛ. В связи с этим был предложен термин «ALK-позитивная АККЛ», или «ALKoma». В литературе чаще встречается название ALK-позитивной АККЛ, так как термин «ALKoma» может быть отнесен и к опухолям другой природы, характеризующихся наличием ALK-белка и его вариантов (миофибробластические опухоли у детей, редко — рабдомиосаркома, нейробластома, ALK-позитивные диффузные B-крупноклеточные лимфомы). В настоящее время нет убедительного ответа на вопрос, представляется ли ALK-негативный вариант AККЛ отдельной нозологической единицей или является подвариантом неспецифицированной периферической T-клеточной лимфомы. Ответ на этот вопрос может быть дан в результате детального изучения молекулярных механизмов лимфомагенеза. Для клинической практики патолог должен диагностировать анапластическую крупноклеточную лимфому согласно строгим критериям, описанным выше, определяя в каждом случае основное — является ли опухоль ALK-позитивным или ALK-негативным вариантом, поскольку высказываются мнения о прогностическом значении этого феномена.

ALK-позитивная АККЛ представляет собой широкий морфологический спектр — от мелкоклеточного до крупноклеточного варианта АККЛ. Ядерная ALK-экспрессия — признак транслокации (2;5) — мелких и крупных клеток опухоли является доказательством, что они принадлежат к одному и тому же неопластическому клону. В некоторых случаях трансформация мелкоклеточного варианта в анапластической крупноклеточной лимфоме классического типа связана с приобретением дополнительной хромосомной аномалии, вовлекающей половую хромосому и хромосомы 6, 7, 9 и 15.

И.В. Поддубная, А.А. Семенова, Н.А. Пробатова
Page 5

1201

Одной из основных черт анапластической крупноклеточной лимфомы (АККЛ) является экспрессия CD30 (КМ)-молекулы. CD30 является 120 kDa трансмембранным цитокиновым рецептором из семейства рецепторов фактора некроза опухоли TNF), для которого был установлен лиганд (CD30L). Растворимая 85 kDa-форма CD30 вырабатывается мембраносвязанной молекулой путем протеолитического распада и может быть обнаружена в больших концентрациях в сыворотке крови пациентов. В крупных анапластических опухолевых клетках экспрессия CD30 ограничена мембраной, цитоплазмой и точечной (гранулярной) реакцией (dot-like) в области аппарата Гольджи. В мелкоклеточном варианте только крупные анапластические клетки (чаще сосредоточенные около сосудов) проявляют положительную экспрессию CD30, в то время как мелкие опухолевые клетки чаще являются слабопозитивными или негативными на CD30. Воспроизводимость диагноза АККЛ по морфологическим признакам составляет 46% и может быть увеличена до 85% при иммунном окрашивании на CD30, и, тем не менее, именно иммунные реакции на CD30 должны всегда проводиться параллельно с определением наличия прочих лимфоидных и нелимфоидных маркеров, потому что экспрессия CD30 не является специфической чертой только АККЛ и наблюдается в нормальных активированных клетках других В- и Т-клеточных лимфоидных и нелимфоидных опухолей, а также при негемопоэтических злокачественных заболеваниях, некоторых карциномах и новообразованиях из герминогенных клеток. Однако при анапластической крупноклеточной лимфоме  характерным является выраженная, интенсивная реакция на CD30 в подавляющем большинстве клеток. Другие неоплазмы могут также характеризо-ваться положительной СР30-реакцией, но обычно менее интенсивной и гетерогенной.

Положительная экспрессия эпителиально-мембранного антигена (ЕМА) наблюдается более чем в 50% случаев АККЛ, хотя в некоторых случаях экспрессия положительна только в части опухолевых клеток. Опыт многих работ показал, что экспрессия EMA при АККЛ чаще наблюдается у детей и молодых пациентов и сочетается с благоприятным прогнозом.

В настоящее время ИВХ-реакцию на определение экспрессии ALK-белка принято считать наиболее специфичным диагностическим методом. Современная усовершенствованная генная технология продемонстрировала аномальную экспрессию кластерина (clusterin) при системных АККЛ и ее отсутствие при кожных формах. Наличие кластерина не коррелирует с экспрессией АLК-белка, что характерно для экспрессии BCL-2 и с-Мус. Было установлено, что экспрессия BCL-2 возможна в основном при АLК-негативных вариантах, а ядерная экспрессия с-Мус, напротив, у АLК-позитивных анапластических крупноклеточных лимфом, что позволяет заключить, что наличие АLК-белка может оказывать влияние на индукцию апоптоза при АККЛ. Системные АККЛ имеют два главных иммунофенотипа: Т- и О-клеточный. Большинство случаев имеют Т-клеточное происхождение, что подтверждается экспрессией одного или нескольких Т-клеточных антигенов. АККЛ О-клеточного фенотипа, возможно, принадлежит к Т-клеточному фенотипу, так как опухолевые клетки обычно экспрессируют цитотоксические молекулы: перфорин, гранзим В (granzyme) и Т1А-1.

Кожная анапластическая крупноклеточная лимфома характеризуется Т-фенотипом, но при этом отличается от системной формы, так как всегда АLK-негативна и обычно не экспрессирует ЕМА и цитотоксические молекулы.

По данным мировой литературы, в 60-70% случаев АККЛ наблюдается t(2;5)(q23q35), которая вызывает слияние гена ALK хромосомы 2 с геном NPM (нуклеофозмин) хромосомы 5. Следует отметить, что при периферических лимфопролиферациях в отличие от случаев, наблюдаемых при острых лейкозах, хромосомная транслокация, ведущая к появлению гибридных генов, редка. Дикий тип NPM-гена отвечает за кодирование филогенетически-консервированного и повсеместно проявляемого 37 kDa кислотного фосфобелглавных аргирофильных нуклеолярных (ядрышковых) белков (AgNOR ядрышек). Основной функцией NPM является перенос только что синтезированных белков в ядрышко. Для выполнения этой функции необходимы домен олигоомеризации N-концевой области и два ядерных сигнала в С-конечной области.

Область ядрышковых организаторов (ОЯОР) представляет собой участок вторичных перетяжек акроцентрических хромосом, где локализованы гены, кодирующие рибосомную РНК (рРНК), и формируется ядрышко непосредственно после деления клетки. С ОЯОР ассоциированы кислые негистоновые аргирофильные белки, регулирующие процесс синтеза рРНК и образование рибосом. Среди аргирофильных белков ОЯОР наиболее охарактеризованы РНК-полимераза I, белки С23 (нуклеолин) и В23 (нуклеофозмин).

Аргирофильные свойства ассоциированных с областью ядрышковых организаторов кислых негистоновых белков используются при выявлении ОЯОР при помощи нитрата серебра. Образующиеся при этом гранулы серебра являются маркерами ОЯОР. Показано, что нитратом серебра выявляются транскрипционно активные ОЯОР, и в этой связи степень аргирофилии ядрышковых структур может рассматриваться как цитохимический эквивалент функциональной активности рибосомных генов. Аргирофильные белки играют важную роль в регуляции клеточного цикла, определяя его продолжительность. При исследовании различных опухолей было выявлено повышение содержания в них белков области ядрышковых организаторов по мере прогрессирования злокачественного процесса. При этом, как было показано экспериментальными исследованиями, наблюдаемое повышение содержания белков ОЯОР происходит не в результате синтеза новых белков этого класса, а в результате усиленного синтеза белков ОЯОР — С23 и В23. Эти результаты позволили рассматривать активность области ядрышковых организаторов как один из критериев разграничения доброкачественных и злокачественных новообразований, выявления опухолей высокой и низкой степени злокачественности, определения прогноза. ALK-ген дикого типа кодирует крупный, гликилизированный, 200 kDa трансмембранный рецептор, ближе всего связанный с Ltk (лейкоцитотирозинкиназа), для которого соответствующий лиганд до сих пор не установлен и его обычная функция не определена. Местонахождение ALK-гена дикого типа в нормальных тканях ограничено поверхностной мембраной и цитоплазмой. Внутрицитоплазматический конец ALK несет тирозинкиназа каталитической области, которая физиологически активируется в результате гомодимеризации и связывания лигандов. Как следствие t (2;5) часть гена NPM, кодирующая аминоконечную область NPM (аминокислоты 1-116), сливается с частью гена ALK, кодирующей всю цитоплазматическую область белка ALK (последние 563 аминокислоты ALK) (рис. 1). В результате ген ALK попадает под контроль промотера NPM, что в свою очередь ведет к перманентному и повсеместному считыванию кода гибридного NPM-ALK-гена и получению 80 kDа рекомбинантного белка, обозначаемого NPM-ALK, или р80 (рис. 1).

Рис. 1. Молекулярная структура нуклеофозмина (NPM), киназы анапластической лимфомы и гибридных форм ALK. Рекомбинантный белок NPM-ALK способен образовывать гомодимеры (путем перекрещивания с NPM дикого типа). Образование гомодимеров ведет к конституционной активации каталитической области ALK путем имитации рецепторной димеризации и активации. In vitro трансфекция NPM-ALK в клеточные линии мышей/крыс ведет к формированию трансформированного фенотипа. Мало известно о сигнальных путях, по которым NPM-ALK оказывает онкогенное действие.

Фосфолипаза С-у, по всей видимости, является важной мишенью для NPM-ALK. На самом деле этот гибридный белок может связываться in vitro с областями Sh3 фосфолипазы С-у, что ведет к ее тирозинфосфорилированию и активации с последующей трансдукцией митогенных сигналов. NPM-ALK, вероятно, связан с фосфатидилинозитом (PI-3K) и производит конститутивную активацию путей антиапоптозной PI-3-киназы/ALK.

Менее ясной представляется роль взаимодействий NPM-ALK и других сигнальных молекул, а именно STAT5 и внутриклеточной областью CD30. In vitro NPM-ALK также связывается с Shc и субстратом инсулинового рецептора (insulin receptor substate 1, IRS-1), но эти взаимодействия не являются необходимыми для трансформации. Наконец, полученные противоречивые сведения, которые свидетельствуют о прямой подаче сигнала от NPM-ALK к соединительному белку GRB2, но в то же время у NPM-ALK не было найдено области, отвечающей за распознавание GRB2. Онкогенные свойства NPM-ALK in vivo подтверждаются экспериментальными данными, показывающими, что инфузия мышиных гемопоэтических клеток с трансфекцией NPM-ALK ведет к развитию лимфом. В то же время эти мышиные лимфомы имеют В-клеточное происхождение и, очевидно, отличаются от ALK-положительной лимфомы, развивающейся у людей, Т- и О-типа. Эти данные наводят на мысль о том, что активация одного и того же тирозинкиназасигнального пути может, с одной стороны, носить онкогенный характер в различных типах клеток, а с другой — свидетельствовать о взаимодействии NPM-ALK с широким диапазоном опухолевых молекул.

Рис. 2. Молекулярные механизмы взаимодействия NPM-ALK.

Для обнаружения NPM-ALK транслокаций в тканевых срезах существует несколько методов: PCR, метод in situ гибридизации, флюоресцентная in situ гибридизация (FISH). Так как при использовании метода PCR возможны артефакты и его применение требует высококачественного RNA, а FISH занимает много времени, иммуногистохимическое исследование, с практической точки зрения, является наиболее удобным и широко используемым методом, так как оно имеет строго определенные показания и легкое исполнение, недорого и дает быстрый результат.

Более того, этот метод позволяет использовать архивный, залитый в парафин материал, что дает возможность судить о природе меченых клеток и архитектонике тканей, а также определять молекулярные варианты АККЛ, которые несут гибридные гены, отличные от NPM-ALK, и не распознаются с помощью PCR.

Поликлональные и с недавних пор крайне специфические моноклональные антитела, направленные против фиксатор-резистентных эпитопов цитоплазматической области ALK, т.е. антитела ALK1  и ALKc, а также антитела против N-концевой области NPM, стали доступными для оптимального иммуногистохимического (ИГХ)-распознавания этих белков в парафиновых срезах. В отличие от копий NPM-ALK и ATIC-ALK, распознающихся с помощью PCR даже в низком содержании в обычных и реактивных лимфоидных тканях, белок ALK не экспрессируется в нормальных тканях, за исключением некоторых клеток нейрогенного происхождения.

Поэтому присутствие ALK-белка при проведении ИГХ-анализа в тканях, отличных от тканей мозга, является свидетельством аномального проявления ALK, обычно в форме связанного с t(2;5) химерного белка NPM-ALK. ИГХ-свидетельство молекулярной связи распознанного ALK c NPM находится в субклеточном распределении белка ALK, который в случае t(2;5) можно увидеть не только в цитоплазме, но и в ядре. Около 15-20% ALK-позитивной AKKA дают неожиданный для t(2;5) ИГХ-рисунок в виде ограниченной цитоплазмой экспрессии ALK и ограниченной ядром экспрессии NPM (N-конец) (рис. 3). На основании этих результатов были высказаны предположения о существовании молекулярных вариантов AKKA, при которых в качестве партнера при слиянии с ALK выступает ген, отличный от NPM, и это приводит к возникновению иных гибридных белков ALK.

Рис. 3. Экспрессия различных гибридных белков ALK. Возможность того, что отличные от NPM гены могут вступать в контакт с геном ALK и приводить к появлению отличных от NPM-ALK рекомбинантных ALK-белков, была высказана в связи с наличием цитогенетических данных, показывающих, что при AKKA ген ALK 2p23 присутствует в генетических аномалиях, отличных от t(2;5), например t(1;2) (q21; p23), t(2;3)(p23q21) и инверсии (p23;q35). Более того, исследования с моноклональными антителами, направленными против ALK и N-концевой части NPM, установили наличие иных ALK белков с 85, 97, 104 и 113 kDa в некоторых случаях анапластической крупноклеточной лимфомы с «аномальным» субклеточным распределением ALK NPM, выявленном при ИГХ-анализе. При использовании ALK1 и ALKc моноклональных антител экспрессия химерных ALK-белков (или вариантов NPM-ALK) обнаружена приблизительно в 60-70% АККЛ. В связи с этим был предложен термин «ALK-позитивная АККЛ», или «ALKoma». В литературе чаще встречается название ALK-позитивной АККЛ, так как термин «ALKoma» может быть отнесен и к опухолям другой природы, характеризующихся наличием ALK-белка и его вариантов (миофибробластические опухоли у детей, редко — рабдомиосаркома, нейробластома, ALK-позитивные диффузные B-крупноклеточные лимфомы). В настоящее время нет убедительного ответа на вопрос, представляется ли ALK-негативный вариант AККЛ отдельной нозологической единицей или является подвариантом неспецифицированной периферической T-клеточной лимфомы. Ответ на этот вопрос может быть дан в результате детального изучения молекулярных механизмов лимфомагенеза. Для клинической практики патолог должен диагностировать анапластическую крупноклеточную лимфому согласно строгим критериям, описанным выше, определяя в каждом случае основное — является ли опухоль ALK-позитивным или ALK-негативным вариантом, поскольку высказываются мнения о прогностическом значении этого феномена.

ALK-позитивная АККЛ представляет собой широкий морфологический спектр — от мелкоклеточного до крупноклеточного варианта АККЛ. Ядерная ALK-экспрессия — признак транслокации (2;5) — мелких и крупных клеток опухоли является доказательством, что они принадлежат к одному и тому же неопластическому клону. В некоторых случаях трансформация мелкоклеточного варианта в анапластической крупноклеточной лимфоме классического типа связана с приобретением дополнительной хромосомной аномалии, вовлекающей половую хромосому и хромосомы 6, 7, 9 и 15.

И.В. Поддубная, А.А. Семенова, Н.А. Пробатова
Page 6

1201

Одной из основных черт анапластической крупноклеточной лимфомы (АККЛ) является экспрессия CD30 (КМ)-молекулы. CD30 является 120 kDa трансмембранным цитокиновым рецептором из семейства рецепторов фактора некроза опухоли TNF), для которого был установлен лиганд (CD30L). Растворимая 85 kDa-форма CD30 вырабатывается мембраносвязанной молекулой путем протеолитического распада и может быть обнаружена в больших концентрациях в сыворотке крови пациентов. В крупных анапластических опухолевых клетках экспрессия CD30 ограничена мембраной, цитоплазмой и точечной (гранулярной) реакцией (dot-like) в области аппарата Гольджи. В мелкоклеточном варианте только крупные анапластические клетки (чаще сосредоточенные около сосудов) проявляют положительную экспрессию CD30, в то время как мелкие опухолевые клетки чаще являются слабопозитивными или негативными на CD30. Воспроизводимость диагноза АККЛ по морфологическим признакам составляет 46% и может быть увеличена до 85% при иммунном окрашивании на CD30, и, тем не менее, именно иммунные реакции на CD30 должны всегда проводиться параллельно с определением наличия прочих лимфоидных и нелимфоидных маркеров, потому что экспрессия CD30 не является специфической чертой только АККЛ и наблюдается в нормальных активированных клетках других В- и Т-клеточных лимфоидных и нелимфоидных опухолей, а также при негемопоэтических злокачественных заболеваниях, некоторых карциномах и новообразованиях из герминогенных клеток. Однако при анапластической крупноклеточной лимфоме  характерным является выраженная, интенсивная реакция на CD30 в подавляющем большинстве клеток. Другие неоплазмы могут также характеризо-ваться положительной СР30-реакцией, но обычно менее интенсивной и гетерогенной.

Положительная экспрессия эпителиально-мембранного антигена (ЕМА) наблюдается более чем в 50% случаев АККЛ, хотя в некоторых случаях экспрессия положительна только в части опухолевых клеток. Опыт многих работ показал, что экспрессия EMA при АККЛ чаще наблюдается у детей и молодых пациентов и сочетается с благоприятным прогнозом.

В настоящее время ИВХ-реакцию на определение экспрессии ALK-белка принято считать наиболее специфичным диагностическим методом. Современная усовершенствованная генная технология продемонстрировала аномальную экспрессию кластерина (clusterin) при системных АККЛ и ее отсутствие при кожных формах. Наличие кластерина не коррелирует с экспрессией АLК-белка, что характерно для экспрессии BCL-2 и с-Мус. Было установлено, что экспрессия BCL-2 возможна в основном при АLК-негативных вариантах, а ядерная экспрессия с-Мус, напротив, у АLК-позитивных анапластических крупноклеточных лимфом, что позволяет заключить, что наличие АLК-белка может оказывать влияние на индукцию апоптоза при АККЛ. Системные АККЛ имеют два главных иммунофенотипа: Т- и О-клеточный. Большинство случаев имеют Т-клеточное происхождение, что подтверждается экспрессией одного или нескольких Т-клеточных антигенов. АККЛ О-клеточного фенотипа, возможно, принадлежит к Т-клеточному фенотипу, так как опухолевые клетки обычно экспрессируют цитотоксические молекулы: перфорин, гранзим В (granzyme) и Т1А-1.

Кожная анапластическая крупноклеточная лимфома характеризуется Т-фенотипом, но при этом отличается от системной формы, так как всегда АLK-негативна и обычно не экспрессирует ЕМА и цитотоксические молекулы.

По данным мировой литературы, в 60-70% случаев АККЛ наблюдается t(2;5)(q23q35), которая вызывает слияние гена ALK хромосомы 2 с геном NPM (нуклеофозмин) хромосомы 5. Следует отметить, что при периферических лимфопролиферациях в отличие от случаев, наблюдаемых при острых лейкозах, хромосомная транслокация, ведущая к появлению гибридных генов, редка. Дикий тип NPM-гена отвечает за кодирование филогенетически-консервированного и повсеместно проявляемого 37 kDa кислотного фосфобелглавных аргирофильных нуклеолярных (ядрышковых) белков (AgNOR ядрышек). Основной функцией NPM является перенос только что синтезированных белков в ядрышко. Для выполнения этой функции необходимы домен олигоомеризации N-концевой области и два ядерных сигнала в С-конечной области.

Область ядрышковых организаторов (ОЯОР) представляет собой участок вторичных перетяжек акроцентрических хромосом, где локализованы гены, кодирующие рибосомную РНК (рРНК), и формируется ядрышко непосредственно после деления клетки. С ОЯОР ассоциированы кислые негистоновые аргирофильные белки, регулирующие процесс синтеза рРНК и образование рибосом. Среди аргирофильных белков ОЯОР наиболее охарактеризованы РНК-полимераза I, белки С23 (нуклеолин) и В23 (нуклеофозмин).

Аргирофильные свойства ассоциированных с областью ядрышковых организаторов кислых негистоновых белков используются при выявлении ОЯОР при помощи нитрата серебра. Образующиеся при этом гранулы серебра являются маркерами ОЯОР. Показано, что нитратом серебра выявляются транскрипционно активные ОЯОР, и в этой связи степень аргирофилии ядрышковых структур может рассматриваться как цитохимический эквивалент функциональной активности рибосомных генов. Аргирофильные белки играют важную роль в регуляции клеточного цикла, определяя его продолжительность. При исследовании различных опухолей было выявлено повышение содержания в них белков области ядрышковых организаторов по мере прогрессирования злокачественного процесса. При этом, как было показано экспериментальными исследованиями, наблюдаемое повышение содержания белков ОЯОР происходит не в результате синтеза новых белков этого класса, а в результате усиленного синтеза белков ОЯОР — С23 и В23. Эти результаты позволили рассматривать активность области ядрышковых организаторов как один из критериев разграничения доброкачественных и злокачественных новообразований, выявления опухолей высокой и низкой степени злокачественности, определения прогноза. ALK-ген дикого типа кодирует крупный, гликилизированный, 200 kDa трансмембранный рецептор, ближе всего связанный с Ltk (лейкоцитотирозинкиназа), для которого соответствующий лиганд до сих пор не установлен и его обычная функция не определена. Местонахождение ALK-гена дикого типа в нормальных тканях ограничено поверхностной мембраной и цитоплазмой. Внутрицитоплазматический конец ALK несет тирозинкиназа каталитической области, которая физиологически активируется в результате гомодимеризации и связывания лигандов. Как следствие t (2;5) часть гена NPM, кодирующая аминоконечную область NPM (аминокислоты 1-116), сливается с частью гена ALK, кодирующей всю цитоплазматическую область белка ALK (последние 563 аминокислоты ALK) (рис. 1). В результате ген ALK попадает под контроль промотера NPM, что в свою очередь ведет к перманентному и повсеместному считыванию кода гибридного NPM-ALK-гена и получению 80 kDа рекомбинантного белка, обозначаемого NPM-ALK, или р80 (рис. 1).

Рис. 1. Молекулярная структура нуклеофозмина (NPM), киназы анапластической лимфомы и гибридных форм ALK. Рекомбинантный белок NPM-ALK способен образовывать гомодимеры (путем перекрещивания с NPM дикого типа). Образование гомодимеров ведет к конституционной активации каталитической области ALK путем имитации рецепторной димеризации и активации. In vitro трансфекция NPM-ALK в клеточные линии мышей/крыс ведет к формированию трансформированного фенотипа. Мало известно о сигнальных путях, по которым NPM-ALK оказывает онкогенное действие.

Фосфолипаза С-у, по всей видимости, является важной мишенью для NPM-ALK. На самом деле этот гибридный белок может связываться in vitro с областями Sh3 фосфолипазы С-у, что ведет к ее тирозинфосфорилированию и активации с последующей трансдукцией митогенных сигналов. NPM-ALK, вероятно, связан с фосфатидилинозитом (PI-3K) и производит конститутивную активацию путей антиапоптозной PI-3-киназы/ALK.

Менее ясной представляется роль взаимодействий NPM-ALK и других сигнальных молекул, а именно STAT5 и внутриклеточной областью CD30. In vitro NPM-ALK также связывается с Shc и субстратом инсулинового рецептора (insulin receptor substate 1, IRS-1), но эти взаимодействия не являются необходимыми для трансформации. Наконец, полученные противоречивые сведения, которые свидетельствуют о прямой подаче сигнала от NPM-ALK к соединительному белку GRB2, но в то же время у NPM-ALK не было найдено области, отвечающей за распознавание GRB2. Онкогенные свойства NPM-ALK in vivo подтверждаются экспериментальными данными, показывающими, что инфузия мышиных гемопоэтических клеток с трансфекцией NPM-ALK ведет к развитию лимфом. В то же время эти мышиные лимфомы имеют В-клеточное происхождение и, очевидно, отличаются от ALK-положительной лимфомы, развивающейся у людей, Т- и О-типа. Эти данные наводят на мысль о том, что активация одного и того же тирозинкиназасигнального пути может, с одной стороны, носить онкогенный характер в различных типах клеток, а с другой — свидетельствовать о взаимодействии NPM-ALK с широким диапазоном опухолевых молекул.

Рис. 2. Молекулярные механизмы взаимодействия NPM-ALK.

Для обнаружения NPM-ALK транслокаций в тканевых срезах существует несколько методов: PCR, метод in situ гибридизации, флюоресцентная in situ гибридизация (FISH). Так как при использовании метода PCR возможны артефакты и его применение требует высококачественного RNA, а FISH занимает много времени, иммуногистохимическое исследование, с практической точки зрения, является наиболее удобным и широко используемым методом, так как оно имеет строго определенные показания и легкое исполнение, недорого и дает быстрый результат.

Более того, этот метод позволяет использовать архивный, залитый в парафин материал, что дает возможность судить о природе меченых клеток и архитектонике тканей, а также определять молекулярные варианты АККЛ, которые несут гибридные гены, отличные от NPM-ALK, и не распознаются с помощью PCR.

Поликлональные и с недавних пор крайне специфические моноклональные антитела, направленные против фиксатор-резистентных эпитопов цитоплазматической области ALK, т.е. антитела ALK1  и ALKc, а также антитела против N-концевой области NPM, стали доступными для оптимального иммуногистохимического (ИГХ)-распознавания этих белков в парафиновых срезах. В отличие от копий NPM-ALK и ATIC-ALK, распознающихся с помощью PCR даже в низком содержании в обычных и реактивных лимфоидных тканях, белок ALK не экспрессируется в нормальных тканях, за исключением некоторых клеток нейрогенного происхождения.

Поэтому присутствие ALK-белка при проведении ИГХ-анализа в тканях, отличных от тканей мозга, является свидетельством аномального проявления ALK, обычно в форме связанного с t(2;5) химерного белка NPM-ALK. ИГХ-свидетельство молекулярной связи распознанного ALK c NPM находится в субклеточном распределении белка ALK, который в случае t(2;5) можно увидеть не только в цитоплазме, но и в ядре. Около 15-20% ALK-позитивной AKKA дают неожиданный для t(2;5) ИГХ-рисунок в виде ограниченной цитоплазмой экспрессии ALK и ограниченной ядром экспрессии NPM (N-конец) (рис. 3). На основании этих результатов были высказаны предположения о существовании молекулярных вариантов AKKA, при которых в качестве партнера при слиянии с ALK выступает ген, отличный от NPM, и это приводит к возникновению иных гибридных белков ALK.

Рис. 3. Экспрессия различных гибридных белков ALK. Возможность того, что отличные от NPM гены могут вступать в контакт с геном ALK и приводить к появлению отличных от NPM-ALK рекомбинантных ALK-белков, была высказана в связи с наличием цитогенетических данных, показывающих, что при AKKA ген ALK 2p23 присутствует в генетических аномалиях, отличных от t(2;5), например t(1;2) (q21; p23), t(2;3)(p23q21) и инверсии (p23;q35). Более того, исследования с моноклональными антителами, направленными против ALK и N-концевой части NPM, установили наличие иных ALK белков с 85, 97, 104 и 113 kDa в некоторых случаях анапластической крупноклеточной лимфомы с «аномальным» субклеточным распределением ALK NPM, выявленном при ИГХ-анализе. При использовании ALK1 и ALKc моноклональных антител экспрессия химерных ALK-белков (или вариантов NPM-ALK) обнаружена приблизительно в 60-70% АККЛ. В связи с этим был предложен термин «ALK-позитивная АККЛ», или «ALKoma». В литературе чаще встречается название ALK-позитивной АККЛ, так как термин «ALKoma» может быть отнесен и к опухолям другой природы, характеризующихся наличием ALK-белка и его вариантов (миофибробластические опухоли у детей, редко — рабдомиосаркома, нейробластома, ALK-позитивные диффузные B-крупноклеточные лимфомы). В настоящее время нет убедительного ответа на вопрос, представляется ли ALK-негативный вариант AККЛ отдельной нозологической единицей или является подвариантом неспецифицированной периферической T-клеточной лимфомы. Ответ на этот вопрос может быть дан в результате детального изучения молекулярных механизмов лимфомагенеза. Для клинической практики патолог должен диагностировать анапластическую крупноклеточную лимфому согласно строгим критериям, описанным выше, определяя в каждом случае основное — является ли опухоль ALK-позитивным или ALK-негативным вариантом, поскольку высказываются мнения о прогностическом значении этого феномена.

ALK-позитивная АККЛ представляет собой широкий морфологический спектр — от мелкоклеточного до крупноклеточного варианта АККЛ. Ядерная ALK-экспрессия — признак транслокации (2;5) — мелких и крупных клеток опухоли является доказательством, что они принадлежат к одному и тому же неопластическому клону. В некоторых случаях трансформация мелкоклеточного варианта в анапластической крупноклеточной лимфоме классического типа связана с приобретением дополнительной хромосомной аномалии, вовлекающей половую хромосому и хромосомы 6, 7, 9 и 15.

И.В. Поддубная, А.А. Семенова, Н.А. Пробатова
Page 7

1201

Одной из основных черт анапластической крупноклеточной лимфомы (АККЛ) является экспрессия CD30 (КМ)-молекулы. CD30 является 120 kDa трансмембранным цитокиновым рецептором из семейства рецепторов фактора некроза опухоли TNF), для которого был установлен лиганд (CD30L). Растворимая 85 kDa-форма CD30 вырабатывается мембраносвязанной молекулой путем протеолитического распада и может быть обнаружена в больших концентрациях в сыворотке крови пациентов. В крупных анапластических опухолевых клетках экспрессия CD30 ограничена мембраной, цитоплазмой и точечной (гранулярной) реакцией (dot-like) в области аппарата Гольджи. В мелкоклеточном варианте только крупные анапластические клетки (чаще сосредоточенные около сосудов) проявляют положительную экспрессию CD30, в то время как мелкие опухолевые клетки чаще являются слабопозитивными или негативными на CD30. Воспроизводимость диагноза АККЛ по морфологическим признакам составляет 46% и может быть увеличена до 85% при иммунном окрашивании на CD30, и, тем не менее, именно иммунные реакции на CD30 должны всегда проводиться параллельно с определением наличия прочих лимфоидных и нелимфоидных маркеров, потому что экспрессия CD30 не является специфической чертой только АККЛ и наблюдается в нормальных активированных клетках других В- и Т-клеточных лимфоидных и нелимфоидных опухолей, а также при негемопоэтических злокачественных заболеваниях, некоторых карциномах и новообразованиях из герминогенных клеток. Однако при анапластической крупноклеточной лимфоме  характерным является выраженная, интенсивная реакция на CD30 в подавляющем большинстве клеток. Другие неоплазмы могут также характеризо-ваться положительной СР30-реакцией, но обычно менее интенсивной и гетерогенной.

Положительная экспрессия эпителиально-мембранного антигена (ЕМА) наблюдается более чем в 50% случаев АККЛ, хотя в некоторых случаях экспрессия положительна только в части опухолевых клеток. Опыт многих работ показал, что экспрессия EMA при АККЛ чаще наблюдается у детей и молодых пациентов и сочетается с благоприятным прогнозом.

В настоящее время ИВХ-реакцию на определение экспрессии ALK-белка принято считать наиболее специфичным диагностическим методом. Современная усовершенствованная генная технология продемонстрировала аномальную экспрессию кластерина (clusterin) при системных АККЛ и ее отсутствие при кожных формах. Наличие кластерина не коррелирует с экспрессией АLК-белка, что характерно для экспрессии BCL-2 и с-Мус. Было установлено, что экспрессия BCL-2 возможна в основном при АLК-негативных вариантах, а ядерная экспрессия с-Мус, напротив, у АLК-позитивных анапластических крупноклеточных лимфом, что позволяет заключить, что наличие АLК-белка может оказывать влияние на индукцию апоптоза при АККЛ. Системные АККЛ имеют два главных иммунофенотипа: Т- и О-клеточный. Большинство случаев имеют Т-клеточное происхождение, что подтверждается экспрессией одного или нескольких Т-клеточных антигенов. АККЛ О-клеточного фенотипа, возможно, принадлежит к Т-клеточному фенотипу, так как опухолевые клетки обычно экспрессируют цитотоксические молекулы: перфорин, гранзим В (granzyme) и Т1А-1.

Кожная анапластическая крупноклеточная лимфома характеризуется Т-фенотипом, но при этом отличается от системной формы, так как всегда АLK-негативна и обычно не экспрессирует ЕМА и цитотоксические молекулы.

По данным мировой литературы, в 60-70% случаев АККЛ наблюдается t(2;5)(q23q35), которая вызывает слияние гена ALK хромосомы 2 с геном NPM (нуклеофозмин) хромосомы 5. Следует отметить, что при периферических лимфопролиферациях в отличие от случаев, наблюдаемых при острых лейкозах, хромосомная транслокация, ведущая к появлению гибридных генов, редка. Дикий тип NPM-гена отвечает за кодирование филогенетически-консервированного и повсеместно проявляемого 37 kDa кислотного фосфобелглавных аргирофильных нуклеолярных (ядрышковых) белков (AgNOR ядрышек). Основной функцией NPM является перенос только что синтезированных белков в ядрышко. Для выполнения этой функции необходимы домен олигоомеризации N-концевой области и два ядерных сигнала в С-конечной области.

Область ядрышковых организаторов (ОЯОР) представляет собой участок вторичных перетяжек акроцентрических хромосом, где локализованы гены, кодирующие рибосомную РНК (рРНК), и формируется ядрышко непосредственно после деления клетки. С ОЯОР ассоциированы кислые негистоновые аргирофильные белки, регулирующие процесс синтеза рРНК и образование рибосом. Среди аргирофильных белков ОЯОР наиболее охарактеризованы РНК-полимераза I, белки С23 (нуклеолин) и В23 (нуклеофозмин).

Аргирофильные свойства ассоциированных с областью ядрышковых организаторов кислых негистоновых белков используются при выявлении ОЯОР при помощи нитрата серебра. Образующиеся при этом гранулы серебра являются маркерами ОЯОР. Показано, что нитратом серебра выявляются транскрипционно активные ОЯОР, и в этой связи степень аргирофилии ядрышковых структур может рассматриваться как цитохимический эквивалент функциональной активности рибосомных генов. Аргирофильные белки играют важную роль в регуляции клеточного цикла, определяя его продолжительность. При исследовании различных опухолей было выявлено повышение содержания в них белков области ядрышковых организаторов по мере прогрессирования злокачественного процесса. При этом, как было показано экспериментальными исследованиями, наблюдаемое повышение содержания белков ОЯОР происходит не в результате синтеза новых белков этого класса, а в результате усиленного синтеза белков ОЯОР — С23 и В23. Эти результаты позволили рассматривать активность области ядрышковых организаторов как один из критериев разграничения доброкачественных и злокачественных новообразований, выявления опухолей высокой и низкой степени злокачественности, определения прогноза. ALK-ген дикого типа кодирует крупный, гликилизированный, 200 kDa трансмембранный рецептор, ближе всего связанный с Ltk (лейкоцитотирозинкиназа), для которого соответствующий лиганд до сих пор не установлен и его обычная функция не определена. Местонахождение ALK-гена дикого типа в нормальных тканях ограничено поверхностной мембраной и цитоплазмой. Внутрицитоплазматический конец ALK несет тирозинкиназа каталитической области, которая физиологически активируется в результате гомодимеризации и связывания лигандов. Как следствие t (2;5) часть гена NPM, кодирующая аминоконечную область NPM (аминокислоты 1-116), сливается с частью гена ALK, кодирующей всю цитоплазматическую область белка ALK (последние 563 аминокислоты ALK) (рис. 1). В результате ген ALK попадает под контроль промотера NPM, что в свою очередь ведет к перманентному и повсеместному считыванию кода гибридного NPM-ALK-гена и получению 80 kDа рекомбинантного белка, обозначаемого NPM-ALK, или р80 (рис. 1).

Рис. 1. Молекулярная структура нуклеофозмина (NPM), киназы анапластической лимфомы и гибридных форм ALK. Рекомбинантный белок NPM-ALK способен образовывать гомодимеры (путем перекрещивания с NPM дикого типа). Образование гомодимеров ведет к конституционной активации каталитической области ALK путем имитации рецепторной димеризации и активации. In vitro трансфекция NPM-ALK в клеточные линии мышей/крыс ведет к формированию трансформированного фенотипа. Мало известно о сигнальных путях, по которым NPM-ALK оказывает онкогенное действие.

Фосфолипаза С-у, по всей видимости, является важной мишенью для NPM-ALK. На самом деле этот гибридный белок может связываться in vitro с областями Sh3 фосфолипазы С-у, что ведет к ее тирозинфосфорилированию и активации с последующей трансдукцией митогенных сигналов. NPM-ALK, вероятно, связан с фосфатидилинозитом (PI-3K) и производит конститутивную активацию путей антиапоптозной PI-3-киназы/ALK.

Менее ясной представляется роль взаимодействий NPM-ALK и других сигнальных молекул, а именно STAT5 и внутриклеточной областью CD30. In vitro NPM-ALK также связывается с Shc и субстратом инсулинового рецептора (insulin receptor substate 1, IRS-1), но эти взаимодействия не являются необходимыми для трансформации. Наконец, полученные противоречивые сведения, которые свидетельствуют о прямой подаче сигнала от NPM-ALK к соединительному белку GRB2, но в то же время у NPM-ALK не было найдено области, отвечающей за распознавание GRB2. Онкогенные свойства NPM-ALK in vivo подтверждаются экспериментальными данными, показывающими, что инфузия мышиных гемопоэтических клеток с трансфекцией NPM-ALK ведет к развитию лимфом. В то же время эти мышиные лимфомы имеют В-клеточное происхождение и, очевидно, отличаются от ALK-положительной лимфомы, развивающейся у людей, Т- и О-типа. Эти данные наводят на мысль о том, что активация одного и того же тирозинкиназасигнального пути может, с одной стороны, носить онкогенный характер в различных типах клеток, а с другой — свидетельствовать о взаимодействии NPM-ALK с широким диапазоном опухолевых молекул.

Рис. 2. Молекулярные механизмы взаимодействия NPM-ALK.

Для обнаружения NPM-ALK транслокаций в тканевых срезах существует несколько методов: PCR, метод in situ гибридизации, флюоресцентная in situ гибридизация (FISH). Так как при использовании метода PCR возможны артефакты и его применение требует высококачественного RNA, а FISH занимает много времени, иммуногистохимическое исследование, с практической точки зрения, является наиболее удобным и широко используемым методом, так как оно имеет строго определенные показания и легкое исполнение, недорого и дает быстрый результат.

Более того, этот метод позволяет использовать архивный, залитый в парафин материал, что дает возможность судить о природе меченых клеток и архитектонике тканей, а также определять молекулярные варианты АККЛ, которые несут гибридные гены, отличные от NPM-ALK, и не распознаются с помощью PCR.

Поликлональные и с недавних пор крайне специфические моноклональные антитела, направленные против фиксатор-резистентных эпитопов цитоплазматической области ALK, т.е. антитела ALK1  и ALKc, а также антитела против N-концевой области NPM, стали доступными для оптимального иммуногистохимического (ИГХ)-распознавания этих белков в парафиновых срезах. В отличие от копий NPM-ALK и ATIC-ALK, распознающихся с помощью PCR даже в низком содержании в обычных и реактивных лимфоидных тканях, белок ALK не экспрессируется в нормальных тканях, за исключением некоторых клеток нейрогенного происхождения.

Поэтому присутствие ALK-белка при проведении ИГХ-анализа в тканях, отличных от тканей мозга, является свидетельством аномального проявления ALK, обычно в форме связанного с t(2;5) химерного белка NPM-ALK. ИГХ-свидетельство молекулярной связи распознанного ALK c NPM находится в субклеточном распределении белка ALK, который в случае t(2;5) можно увидеть не только в цитоплазме, но и в ядре. Около 15-20% ALK-позитивной AKKA дают неожиданный для t(2;5) ИГХ-рисунок в виде ограниченной цитоплазмой экспрессии ALK и ограниченной ядром экспрессии NPM (N-конец) (рис. 3). На основании этих результатов были высказаны предположения о существовании молекулярных вариантов AKKA, при которых в качестве партнера при слиянии с ALK выступает ген, отличный от NPM, и это приводит к возникновению иных гибридных белков ALK.

Рис. 3. Экспрессия различных гибридных белков ALK. Возможность того, что отличные от NPM гены могут вступать в контакт с геном ALK и приводить к появлению отличных от NPM-ALK рекомбинантных ALK-белков, была высказана в связи с наличием цитогенетических данных, показывающих, что при AKKA ген ALK 2p23 присутствует в генетических аномалиях, отличных от t(2;5), например t(1;2) (q21; p23), t(2;3)(p23q21) и инверсии (p23;q35). Более того, исследования с моноклональными антителами, направленными против ALK и N-концевой части NPM, установили наличие иных ALK белков с 85, 97, 104 и 113 kDa в некоторых случаях анапластической крупноклеточной лимфомы с «аномальным» субклеточным распределением ALK NPM, выявленном при ИГХ-анализе. При использовании ALK1 и ALKc моноклональных антител экспрессия химерных ALK-белков (или вариантов NPM-ALK) обнаружена приблизительно в 60-70% АККЛ. В связи с этим был предложен термин «ALK-позитивная АККЛ», или «ALKoma». В литературе чаще встречается название ALK-позитивной АККЛ, так как термин «ALKoma» может быть отнесен и к опухолям другой природы, характеризующихся наличием ALK-белка и его вариантов (миофибробластические опухоли у детей, редко — рабдомиосаркома, нейробластома, ALK-позитивные диффузные B-крупноклеточные лимфомы). В настоящее время нет убедительного ответа на вопрос, представляется ли ALK-негативный вариант AККЛ отдельной нозологической единицей или является подвариантом неспецифицированной периферической T-клеточной лимфомы. Ответ на этот вопрос может быть дан в результате детального изучения молекулярных механизмов лимфомагенеза. Для клинической практики патолог должен диагностировать анапластическую крупноклеточную лимфому согласно строгим критериям, описанным выше, определяя в каждом случае основное — является ли опухоль ALK-позитивным или ALK-негативным вариантом, поскольку высказываются мнения о прогностическом значении этого феномена.

ALK-позитивная АККЛ представляет собой широкий морфологический спектр — от мелкоклеточного до крупноклеточного варианта АККЛ. Ядерная ALK-экспрессия — признак транслокации (2;5) — мелких и крупных клеток опухоли является доказательством, что они принадлежат к одному и тому же неопластическому клону. В некоторых случаях трансформация мелкоклеточного варианта в анапластической крупноклеточной лимфоме классического типа связана с приобретением дополнительной хромосомной аномалии, вовлекающей половую хромосому и хромосомы 6, 7, 9 и 15.

И.В. Поддубная, А.А. Семенова, Н.А. Пробатова
Page 8

1201

Одной из основных черт анапластической крупноклеточной лимфомы (АККЛ) является экспрессия CD30 (КМ)-молекулы. CD30 является 120 kDa трансмембранным цитокиновым рецептором из семейства рецепторов фактора некроза опухоли TNF), для которого был установлен лиганд (CD30L). Растворимая 85 kDa-форма CD30 вырабатывается мембраносвязанной молекулой путем протеолитического распада и может быть обнаружена в больших концентрациях в сыворотке крови пациентов. В крупных анапластических опухолевых клетках экспрессия CD30 ограничена мембраной, цитоплазмой и точечной (гранулярной) реакцией (dot-like) в области аппарата Гольджи. В мелкоклеточном варианте только крупные анапластические клетки (чаще сосредоточенные около сосудов) проявляют положительную экспрессию CD30, в то время как мелкие опухолевые клетки чаще являются слабопозитивными или негативными на CD30. Воспроизводимость диагноза АККЛ по морфологическим признакам составляет 46% и может быть увеличена до 85% при иммунном окрашивании на CD30, и, тем не менее, именно иммунные реакции на CD30 должны всегда проводиться параллельно с определением наличия прочих лимфоидных и нелимфоидных маркеров, потому что экспрессия CD30 не является специфической чертой только АККЛ и наблюдается в нормальных активированных клетках других В- и Т-клеточных лимфоидных и нелимфоидных опухолей, а также при негемопоэтических злокачественных заболеваниях, некоторых карциномах и новообразованиях из герминогенных клеток. Однако при анапластической крупноклеточной лимфоме  характерным является выраженная, интенсивная реакция на CD30 в подавляющем большинстве клеток. Другие неоплазмы могут также характеризо-ваться положительной СР30-реакцией, но обычно менее интенсивной и гетерогенной.

Положительная экспрессия эпителиально-мембранного антигена (ЕМА) наблюдается более чем в 50% случаев АККЛ, хотя в некоторых случаях экспрессия положительна только в части опухолевых клеток. Опыт многих работ показал, что экспрессия EMA при АККЛ чаще наблюдается у детей и молодых пациентов и сочетается с благоприятным прогнозом.

В настоящее время ИВХ-реакцию на определение экспрессии ALK-белка принято считать наиболее специфичным диагностическим методом. Современная усовершенствованная генная технология продемонстрировала аномальную экспрессию кластерина (clusterin) при системных АККЛ и ее отсутствие при кожных формах. Наличие кластерина не коррелирует с экспрессией АLК-белка, что характерно для экспрессии BCL-2 и с-Мус. Было установлено, что экспрессия BCL-2 возможна в основном при АLК-негативных вариантах, а ядерная экспрессия с-Мус, напротив, у АLК-позитивных анапластических крупноклеточных лимфом, что позволяет заключить, что наличие АLК-белка может оказывать влияние на индукцию апоптоза при АККЛ. Системные АККЛ имеют два главных иммунофенотипа: Т- и О-клеточный. Большинство случаев имеют Т-клеточное происхождение, что подтверждается экспрессией одного или нескольких Т-клеточных антигенов. АККЛ О-клеточного фенотипа, возможно, принадлежит к Т-клеточному фенотипу, так как опухолевые клетки обычно экспрессируют цитотоксические молекулы: перфорин, гранзим В (granzyme) и Т1А-1.

Кожная анапластическая крупноклеточная лимфома характеризуется Т-фенотипом, но при этом отличается от системной формы, так как всегда АLK-негативна и обычно не экспрессирует ЕМА и цитотоксические молекулы.

По данным мировой литературы, в 60-70% случаев АККЛ наблюдается t(2;5)(q23q35), которая вызывает слияние гена ALK хромосомы 2 с геном NPM (нуклеофозмин) хромосомы 5. Следует отметить, что при периферических лимфопролиферациях в отличие от случаев, наблюдаемых при острых лейкозах, хромосомная транслокация, ведущая к появлению гибридных генов, редка. Дикий тип NPM-гена отвечает за кодирование филогенетически-консервированного и повсеместно проявляемого 37 kDa кислотного фосфобелглавных аргирофильных нуклеолярных (ядрышковых) белков (AgNOR ядрышек). Основной функцией NPM является перенос только что синтезированных белков в ядрышко. Для выполнения этой функции необходимы домен олигоомеризации N-концевой области и два ядерных сигнала в С-конечной области.

Область ядрышковых организаторов (ОЯОР) представляет собой участок вторичных перетяжек акроцентрических хромосом, где локализованы гены, кодирующие рибосомную РНК (рРНК), и формируется ядрышко непосредственно после деления клетки. С ОЯОР ассоциированы кислые негистоновые аргирофильные белки, регулирующие процесс синтеза рРНК и образование рибосом. Среди аргирофильных белков ОЯОР наиболее охарактеризованы РНК-полимераза I, белки С23 (нуклеолин) и В23 (нуклеофозмин).

Аргирофильные свойства ассоциированных с областью ядрышковых организаторов кислых негистоновых белков используются при выявлении ОЯОР при помощи нитрата серебра. Образующиеся при этом гранулы серебра являются маркерами ОЯОР. Показано, что нитратом серебра выявляются транскрипционно активные ОЯОР, и в этой связи степень аргирофилии ядрышковых структур может рассматриваться как цитохимический эквивалент функциональной активности рибосомных генов. Аргирофильные белки играют важную роль в регуляции клеточного цикла, определяя его продолжительность. При исследовании различных опухолей было выявлено повышение содержания в них белков области ядрышковых организаторов по мере прогрессирования злокачественного процесса. При этом, как было показано экспериментальными исследованиями, наблюдаемое повышение содержания белков ОЯОР происходит не в результате синтеза новых белков этого класса, а в результате усиленного синтеза белков ОЯОР — С23 и В23. Эти результаты позволили рассматривать активность области ядрышковых организаторов как один из критериев разграничения доброкачественных и злокачественных новообразований, выявления опухолей высокой и низкой степени злокачественности, определения прогноза. ALK-ген дикого типа кодирует крупный, гликилизированный, 200 kDa трансмембранный рецептор, ближе всего связанный с Ltk (лейкоцитотирозинкиназа), для которого соответствующий лиганд до сих пор не установлен и его обычная функция не определена. Местонахождение ALK-гена дикого типа в нормальных тканях ограничено поверхностной мембраной и цитоплазмой. Внутрицитоплазматический конец ALK несет тирозинкиназа каталитической области, которая физиологически активируется в результате гомодимеризации и связывания лигандов. Как следствие t (2;5) часть гена NPM, кодирующая аминоконечную область NPM (аминокислоты 1-116), сливается с частью гена ALK, кодирующей всю цитоплазматическую область белка ALK (последние 563 аминокислоты ALK) (рис. 1). В результате ген ALK попадает под контроль промотера NPM, что в свою очередь ведет к перманентному и повсеместному считыванию кода гибридного NPM-ALK-гена и получению 80 kDа рекомбинантного белка, обозначаемого NPM-ALK, или р80 (рис. 1).

Рис. 1. Молекулярная структура нуклеофозмина (NPM), киназы анапластической лимфомы и гибридных форм ALK. Рекомбинантный белок NPM-ALK способен образовывать гомодимеры (путем перекрещивания с NPM дикого типа). Образование гомодимеров ведет к конституционной активации каталитической области ALK путем имитации рецепторной димеризации и активации. In vitro трансфекция NPM-ALK в клеточные линии мышей/крыс ведет к формированию трансформированного фенотипа. Мало известно о сигнальных путях, по которым NPM-ALK оказывает онкогенное действие.

Фосфолипаза С-у, по всей видимости, является важной мишенью для NPM-ALK. На самом деле этот гибридный белок может связываться in vitro с областями Sh3 фосфолипазы С-у, что ведет к ее тирозинфосфорилированию и активации с последующей трансдукцией митогенных сигналов. NPM-ALK, вероятно, связан с фосфатидилинозитом (PI-3K) и производит конститутивную активацию путей антиапоптозной PI-3-киназы/ALK.

Менее ясной представляется роль взаимодействий NPM-ALK и других сигнальных молекул, а именно STAT5 и внутриклеточной областью CD30. In vitro NPM-ALK также связывается с Shc и субстратом инсулинового рецептора (insulin receptor substate 1, IRS-1), но эти взаимодействия не являются необходимыми для трансформации. Наконец, полученные противоречивые сведения, которые свидетельствуют о прямой подаче сигнала от NPM-ALK к соединительному белку GRB2, но в то же время у NPM-ALK не было найдено области, отвечающей за распознавание GRB2. Онкогенные свойства NPM-ALK in vivo подтверждаются экспериментальными данными, показывающими, что инфузия мышиных гемопоэтических клеток с трансфекцией NPM-ALK ведет к развитию лимфом. В то же время эти мышиные лимфомы имеют В-клеточное происхождение и, очевидно, отличаются от ALK-положительной лимфомы, развивающейся у людей, Т- и О-типа. Эти данные наводят на мысль о том, что активация одного и того же тирозинкиназасигнального пути может, с одной стороны, носить онкогенный характер в различных типах клеток, а с другой — свидетельствовать о взаимодействии NPM-ALK с широким диапазоном опухолевых молекул.

Рис. 2. Молекулярные механизмы взаимодействия NPM-ALK.

Для обнаружения NPM-ALK транслокаций в тканевых срезах существует несколько методов: PCR, метод in situ гибридизации, флюоресцентная in situ гибридизация (FISH). Так как при использовании метода PCR возможны артефакты и его применение требует высококачественного RNA, а FISH занимает много времени, иммуногистохимическое исследование, с практической точки зрения, является наиболее удобным и широко используемым методом, так как оно имеет строго определенные показания и легкое исполнение, недорого и дает быстрый результат.

Более того, этот метод позволяет использовать архивный, залитый в парафин материал, что дает возможность судить о природе меченых клеток и архитектонике тканей, а также определять молекулярные варианты АККЛ, которые несут гибридные гены, отличные от NPM-ALK, и не распознаются с помощью PCR.

Поликлональные и с недавних пор крайне специфические моноклональные антитела, направленные против фиксатор-резистентных эпитопов цитоплазматической области ALK, т.е. антитела ALK1  и ALKc, а также антитела против N-концевой области NPM, стали доступными для оптимального иммуногистохимического (ИГХ)-распознавания этих белков в парафиновых срезах. В отличие от копий NPM-ALK и ATIC-ALK, распознающихся с помощью PCR даже в низком содержании в обычных и реактивных лимфоидных тканях, белок ALK не экспрессируется в нормальных тканях, за исключением некоторых клеток нейрогенного происхождения.

Поэтому присутствие ALK-белка при проведении ИГХ-анализа в тканях, отличных от тканей мозга, является свидетельством аномального проявления ALK, обычно в форме связанного с t(2;5) химерного белка NPM-ALK. ИГХ-свидетельство молекулярной связи распознанного ALK c NPM находится в субклеточном распределении белка ALK, который в случае t(2;5) можно увидеть не только в цитоплазме, но и в ядре. Около 15-20% ALK-позитивной AKKA дают неожиданный для t(2;5) ИГХ-рисунок в виде ограниченной цитоплазмой экспрессии ALK и ограниченной ядром экспрессии NPM (N-конец) (рис. 3). На основании этих результатов были высказаны предположения о существовании молекулярных вариантов AKKA, при которых в качестве партнера при слиянии с ALK выступает ген, отличный от NPM, и это приводит к возникновению иных гибридных белков ALK.

Рис. 3. Экспрессия различных гибридных белков ALK. Возможность того, что отличные от NPM гены могут вступать в контакт с геном ALK и приводить к появлению отличных от NPM-ALK рекомбинантных ALK-белков, была высказана в связи с наличием цитогенетических данных, показывающих, что при AKKA ген ALK 2p23 присутствует в генетических аномалиях, отличных от t(2;5), например t(1;2) (q21; p23), t(2;3)(p23q21) и инверсии (p23;q35). Более того, исследования с моноклональными антителами, направленными против ALK и N-концевой части NPM, установили наличие иных ALK белков с 85, 97, 104 и 113 kDa в некоторых случаях анапластической крупноклеточной лимфомы с «аномальным» субклеточным распределением ALK NPM, выявленном при ИГХ-анализе. При использовании ALK1 и ALKc моноклональных антител экспрессия химерных ALK-белков (или вариантов NPM-ALK) обнаружена приблизительно в 60-70% АККЛ. В связи с этим был предложен термин «ALK-позитивная АККЛ», или «ALKoma». В литературе чаще встречается название ALK-позитивной АККЛ, так как термин «ALKoma» может быть отнесен и к опухолям другой природы, характеризующихся наличием ALK-белка и его вариантов (миофибробластические опухоли у детей, редко — рабдомиосаркома, нейробластома, ALK-позитивные диффузные B-крупноклеточные лимфомы). В настоящее время нет убедительного ответа на вопрос, представляется ли ALK-негативный вариант AККЛ отдельной нозологической единицей или является подвариантом неспецифицированной периферической T-клеточной лимфомы. Ответ на этот вопрос может быть дан в результате детального изучения молекулярных механизмов лимфомагенеза. Для клинической практики патолог должен диагностировать анапластическую крупноклеточную лимфому согласно строгим критериям, описанным выше, определяя в каждом случае основное — является ли опухоль ALK-позитивным или ALK-негативным вариантом, поскольку высказываются мнения о прогностическом значении этого феномена.

ALK-позитивная АККЛ представляет собой широкий морфологический спектр — от мелкоклеточного до крупноклеточного варианта АККЛ. Ядерная ALK-экспрессия — признак транслокации (2;5) — мелких и крупных клеток опухоли является доказательством, что они принадлежат к одному и тому же неопластическому клону. В некоторых случаях трансформация мелкоклеточного варианта в анапластической крупноклеточной лимфоме классического типа связана с приобретением дополнительной хромосомной аномалии, вовлекающей половую хромосому и хромосомы 6, 7, 9 и 15.

И.В. Поддубная, А.А. Семенова, Н.А. Пробатова
Page 9

1201

Одной из основных черт анапластической крупноклеточной лимфомы (АККЛ) является экспрессия CD30 (КМ)-молекулы. CD30 является 120 kDa трансмембранным цитокиновым рецептором из семейства рецепторов фактора некроза опухоли TNF), для которого был установлен лиганд (CD30L). Растворимая 85 kDa-форма CD30 вырабатывается мембраносвязанной молекулой путем протеолитического распада и может быть обнаружена в больших концентрациях в сыворотке крови пациентов. В крупных анапластических опухолевых клетках экспрессия CD30 ограничена мембраной, цитоплазмой и точечной (гранулярной) реакцией (dot-like) в области аппарата Гольджи. В мелкоклеточном варианте только крупные анапластические клетки (чаще сосредоточенные около сосудов) проявляют положительную экспрессию CD30, в то время как мелкие опухолевые клетки чаще являются слабопозитивными или негативными на CD30. Воспроизводимость диагноза АККЛ по морфологическим признакам составляет 46% и может быть увеличена до 85% при иммунном окрашивании на CD30, и, тем не менее, именно иммунные реакции на CD30 должны всегда проводиться параллельно с определением наличия прочих лимфоидных и нелимфоидных маркеров, потому что экспрессия CD30 не является специфической чертой только АККЛ и наблюдается в нормальных активированных клетках других В- и Т-клеточных лимфоидных и нелимфоидных опухолей, а также при негемопоэтических злокачественных заболеваниях, некоторых карциномах и новообразованиях из герминогенных клеток. Однако при анапластической крупноклеточной лимфоме  характерным является выраженная, интенсивная реакция на CD30 в подавляющем большинстве клеток. Другие неоплазмы могут также характеризо-ваться положительной СР30-реакцией, но обычно менее интенсивной и гетерогенной.

Положительная экспрессия эпителиально-мембранного антигена (ЕМА) наблюдается более чем в 50% случаев АККЛ, хотя в некоторых случаях экспрессия положительна только в части опухолевых клеток. Опыт многих работ показал, что экспрессия EMA при АККЛ чаще наблюдается у детей и молодых пациентов и сочетается с благоприятным прогнозом.

В настоящее время ИВХ-реакцию на определение экспрессии ALK-белка принято считать наиболее специфичным диагностическим методом. Современная усовершенствованная генная технология продемонстрировала аномальную экспрессию кластерина (clusterin) при системных АККЛ и ее отсутствие при кожных формах. Наличие кластерина не коррелирует с экспрессией АLК-белка, что характерно для экспрессии BCL-2 и с-Мус. Было установлено, что экспрессия BCL-2 возможна в основном при АLК-негативных вариантах, а ядерная экспрессия с-Мус, напротив, у АLК-позитивных анапластических крупноклеточных лимфом, что позволяет заключить, что наличие АLК-белка может оказывать влияние на индукцию апоптоза при АККЛ. Системные АККЛ имеют два главных иммунофенотипа: Т- и О-клеточный. Большинство случаев имеют Т-клеточное происхождение, что подтверждается экспрессией одного или нескольких Т-клеточных антигенов. АККЛ О-клеточного фенотипа, возможно, принадлежит к Т-клеточному фенотипу, так как опухолевые клетки обычно экспрессируют цитотоксические молекулы: перфорин, гранзим В (granzyme) и Т1А-1.

Кожная анапластическая крупноклеточная лимфома характеризуется Т-фенотипом, но при этом отличается от системной формы, так как всегда АLK-негативна и обычно не экспрессирует ЕМА и цитотоксические молекулы.

По данным мировой литературы, в 60-70% случаев АККЛ наблюдается t(2;5)(q23q35), которая вызывает слияние гена ALK хромосомы 2 с геном NPM (нуклеофозмин) хромосомы 5. Следует отметить, что при периферических лимфопролиферациях в отличие от случаев, наблюдаемых при острых лейкозах, хромосомная транслокация, ведущая к появлению гибридных генов, редка. Дикий тип NPM-гена отвечает за кодирование филогенетически-консервированного и повсеместно проявляемого 37 kDa кислотного фосфобелглавных аргирофильных нуклеолярных (ядрышковых) белков (AgNOR ядрышек). Основной функцией NPM является перенос только что синтезированных белков в ядрышко. Для выполнения этой функции необходимы домен олигоомеризации N-концевой области и два ядерных сигнала в С-конечной области.

Область ядрышковых организаторов (ОЯОР) представляет собой участок вторичных перетяжек акроцентрических хромосом, где локализованы гены, кодирующие рибосомную РНК (рРНК), и формируется ядрышко непосредственно после деления клетки. С ОЯОР ассоциированы кислые негистоновые аргирофильные белки, регулирующие процесс синтеза рРНК и образование рибосом. Среди аргирофильных белков ОЯОР наиболее охарактеризованы РНК-полимераза I, белки С23 (нуклеолин) и В23 (нуклеофозмин).

Аргирофильные свойства ассоциированных с областью ядрышковых организаторов кислых негистоновых белков используются при выявлении ОЯОР при помощи нитрата серебра. Образующиеся при этом гранулы серебра являются маркерами ОЯОР. Показано, что нитратом серебра выявляются транскрипционно активные ОЯОР, и в этой связи степень аргирофилии ядрышковых структур может рассматриваться как цитохимический эквивалент функциональной активности рибосомных генов. Аргирофильные белки играют важную роль в регуляции клеточного цикла, определяя его продолжительность. При исследовании различных опухолей было выявлено повышение содержания в них белков области ядрышковых организаторов по мере прогрессирования злокачественного процесса. При этом, как было показано экспериментальными исследованиями, наблюдаемое повышение содержания белков ОЯОР происходит не в результате синтеза новых белков этого класса, а в результате усиленного синтеза белков ОЯОР — С23 и В23. Эти результаты позволили рассматривать активность области ядрышковых организаторов как один из критериев разграничения доброкачественных и злокачественных новообразований, выявления опухолей высокой и низкой степени злокачественности, определения прогноза. ALK-ген дикого типа кодирует крупный, гликилизированный, 200 kDa трансмембранный рецептор, ближе всего связанный с Ltk (лейкоцитотирозинкиназа), для которого соответствующий лиганд до сих пор не установлен и его обычная функция не определена. Местонахождение ALK-гена дикого типа в нормальных тканях ограничено поверхностной мембраной и цитоплазмой. Внутрицитоплазматический конец ALK несет тирозинкиназа каталитической области, которая физиологически активируется в результате гомодимеризации и связывания лигандов. Как следствие t (2;5) часть гена NPM, кодирующая аминоконечную область NPM (аминокислоты 1-116), сливается с частью гена ALK, кодирующей всю цитоплазматическую область белка ALK (последние 563 аминокислоты ALK) (рис. 1). В результате ген ALK попадает под контроль промотера NPM, что в свою очередь ведет к перманентному и повсеместному считыванию кода гибридного NPM-ALK-гена и получению 80 kDа рекомбинантного белка, обозначаемого NPM-ALK, или р80 (рис. 1).

Рис. 1. Молекулярная структура нуклеофозмина (NPM), киназы анапластической лимфомы и гибридных форм ALK. Рекомбинантный белок NPM-ALK способен образовывать гомодимеры (путем перекрещивания с NPM дикого типа). Образование гомодимеров ведет к конституционной активации каталитической области ALK путем имитации рецепторной димеризации и активации. In vitro трансфекция NPM-ALK в клеточные линии мышей/крыс ведет к формированию трансформированного фенотипа. Мало известно о сигнальных путях, по которым NPM-ALK оказывает онкогенное действие.

Фосфолипаза С-у, по всей видимости, является важной мишенью для NPM-ALK. На самом деле этот гибридный белок может связываться in vitro с областями Sh3 фосфолипазы С-у, что ведет к ее тирозинфосфорилированию и активации с последующей трансдукцией митогенных сигналов. NPM-ALK, вероятно, связан с фосфатидилинозитом (PI-3K) и производит конститутивную активацию путей антиапоптозной PI-3-киназы/ALK.

Менее ясной представляется роль взаимодействий NPM-ALK и других сигнальных молекул, а именно STAT5 и внутриклеточной областью CD30. In vitro NPM-ALK также связывается с Shc и субстратом инсулинового рецептора (insulin receptor substate 1, IRS-1), но эти взаимодействия не являются необходимыми для трансформации. Наконец, полученные противоречивые сведения, которые свидетельствуют о прямой подаче сигнала от NPM-ALK к соединительному белку GRB2, но в то же время у NPM-ALK не было найдено области, отвечающей за распознавание GRB2. Онкогенные свойства NPM-ALK in vivo подтверждаются экспериментальными данными, показывающими, что инфузия мышиных гемопоэтических клеток с трансфекцией NPM-ALK ведет к развитию лимфом. В то же время эти мышиные лимфомы имеют В-клеточное происхождение и, очевидно, отличаются от ALK-положительной лимфомы, развивающейся у людей, Т- и О-типа. Эти данные наводят на мысль о том, что активация одного и того же тирозинкиназасигнального пути может, с одной стороны, носить онкогенный характер в различных типах клеток, а с другой — свидетельствовать о взаимодействии NPM-ALK с широким диапазоном опухолевых молекул.

Рис. 2. Молекулярные механизмы взаимодействия NPM-ALK.

Для обнаружения NPM-ALK транслокаций в тканевых срезах существует несколько методов: PCR, метод in situ гибридизации, флюоресцентная in situ гибридизация (FISH). Так как при использовании метода PCR возможны артефакты и его применение требует высококачественного RNA, а FISH занимает много времени, иммуногистохимическое исследование, с практической точки зрения, является наиболее удобным и широко используемым методом, так как оно имеет строго определенные показания и легкое исполнение, недорого и дает быстрый результат.

Более того, этот метод позволяет использовать архивный, залитый в парафин материал, что дает возможность судить о природе меченых клеток и архитектонике тканей, а также определять молекулярные варианты АККЛ, которые несут гибридные гены, отличные от NPM-ALK, и не распознаются с помощью PCR.

Поликлональные и с недавних пор крайне специфические моноклональные антитела, направленные против фиксатор-резистентных эпитопов цитоплазматической области ALK, т.е. антитела ALK1  и ALKc, а также антитела против N-концевой области NPM, стали доступными для оптимального иммуногистохимического (ИГХ)-распознавания этих белков в парафиновых срезах. В отличие от копий NPM-ALK и ATIC-ALK, распознающихся с помощью PCR даже в низком содержании в обычных и реактивных лимфоидных тканях, белок ALK не экспрессируется в нормальных тканях, за исключением некоторых клеток нейрогенного происхождения.

Поэтому присутствие ALK-белка при проведении ИГХ-анализа в тканях, отличных от тканей мозга, является свидетельством аномального проявления ALK, обычно в форме связанного с t(2;5) химерного белка NPM-ALK. ИГХ-свидетельство молекулярной связи распознанного ALK c NPM находится в субклеточном распределении белка ALK, который в случае t(2;5) можно увидеть не только в цитоплазме, но и в ядре. Около 15-20% ALK-позитивной AKKA дают неожиданный для t(2;5) ИГХ-рисунок в виде ограниченной цитоплазмой экспрессии ALK и ограниченной ядром экспрессии NPM (N-конец) (рис. 3). На основании этих результатов были высказаны предположения о существовании молекулярных вариантов AKKA, при которых в качестве партнера при слиянии с ALK выступает ген, отличный от NPM, и это приводит к возникновению иных гибридных белков ALK.

Рис. 3. Экспрессия различных гибридных белков ALK. Возможность того, что отличные от NPM гены могут вступать в контакт с геном ALK и приводить к появлению отличных от NPM-ALK рекомбинантных ALK-белков, была высказана в связи с наличием цитогенетических данных, показывающих, что при AKKA ген ALK 2p23 присутствует в генетических аномалиях, отличных от t(2;5), например t(1;2) (q21; p23), t(2;3)(p23q21) и инверсии (p23;q35). Более того, исследования с моноклональными антителами, направленными против ALK и N-концевой части NPM, установили наличие иных ALK белков с 85, 97, 104 и 113 kDa в некоторых случаях анапластической крупноклеточной лимфомы с «аномальным» субклеточным распределением ALK NPM, выявленном при ИГХ-анализе. При использовании ALK1 и ALKc моноклональных антител экспрессия химерных ALK-белков (или вариантов NPM-ALK) обнаружена приблизительно в 60-70% АККЛ. В связи с этим был предложен термин «ALK-позитивная АККЛ», или «ALKoma». В литературе чаще встречается название ALK-позитивной АККЛ, так как термин «ALKoma» может быть отнесен и к опухолям другой природы, характеризующихся наличием ALK-белка и его вариантов (миофибробластические опухоли у детей, редко — рабдомиосаркома, нейробластома, ALK-позитивные диффузные B-крупноклеточные лимфомы). В настоящее время нет убедительного ответа на вопрос, представляется ли ALK-негативный вариант AККЛ отдельной нозологической единицей или является подвариантом неспецифицированной периферической T-клеточной лимфомы. Ответ на этот вопрос может быть дан в результате детального изучения молекулярных механизмов лимфомагенеза. Для клинической практики патолог должен диагностировать анапластическую крупноклеточную лимфому согласно строгим критериям, описанным выше, определяя в каждом случае основное — является ли опухоль ALK-позитивным или ALK-негативным вариантом, поскольку высказываются мнения о прогностическом значении этого феномена.

ALK-позитивная АККЛ представляет собой широкий морфологический спектр — от мелкоклеточного до крупноклеточного варианта АККЛ. Ядерная ALK-экспрессия — признак транслокации (2;5) — мелких и крупных клеток опухоли является доказательством, что они принадлежат к одному и тому же неопластическому клону. В некоторых случаях трансформация мелкоклеточного варианта в анапластической крупноклеточной лимфоме классического типа связана с приобретением дополнительной хромосомной аномалии, вовлекающей половую хромосому и хромосомы 6, 7, 9 и 15.

И.В. Поддубная, А.А. Семенова, Н.А. Пробатова
Page 10

1201

Одной из основных черт анапластической крупноклеточной лимфомы (АККЛ) является экспрессия CD30 (КМ)-молекулы. CD30 является 120 kDa трансмембранным цитокиновым рецептором из семейства рецепторов фактора некроза опухоли TNF), для которого был установлен лиганд (CD30L). Растворимая 85 kDa-форма CD30 вырабатывается мембраносвязанной молекулой путем протеолитического распада и может быть обнаружена в больших концентрациях в сыворотке крови пациентов. В крупных анапластических опухолевых клетках экспрессия CD30 ограничена мембраной, цитоплазмой и точечной (гранулярной) реакцией (dot-like) в области аппарата Гольджи. В мелкоклеточном варианте только крупные анапластические клетки (чаще сосредоточенные около сосудов) проявляют положительную экспрессию CD30, в то время как мелкие опухолевые клетки чаще являются слабопозитивными или негативными на CD30. Воспроизводимость диагноза АККЛ по морфологическим признакам составляет 46% и может быть увеличена до 85% при иммунном окрашивании на CD30, и, тем не менее, именно иммунные реакции на CD30 должны всегда проводиться параллельно с определением наличия прочих лимфоидных и нелимфоидных маркеров, потому что экспрессия CD30 не является специфической чертой только АККЛ и наблюдается в нормальных активированных клетках других В- и Т-клеточных лимфоидных и нелимфоидных опухолей, а также при негемопоэтических злокачественных заболеваниях, некоторых карциномах и новообразованиях из герминогенных клеток. Однако при анапластической крупноклеточной лимфоме  характерным является выраженная, интенсивная реакция на CD30 в подавляющем большинстве клеток. Другие неоплазмы могут также характеризо-ваться положительной СР30-реакцией, но обычно менее интенсивной и гетерогенной.

Положительная экспрессия эпителиально-мембранного антигена (ЕМА) наблюдается более чем в 50% случаев АККЛ, хотя в некоторых случаях экспрессия положительна только в части опухолевых клеток. Опыт многих работ показал, что экспрессия EMA при АККЛ чаще наблюдается у детей и молодых пациентов и сочетается с благоприятным прогнозом.

В настоящее время ИВХ-реакцию на определение экспрессии ALK-белка принято считать наиболее специфичным диагностическим методом. Современная усовершенствованная генная технология продемонстрировала аномальную экспрессию кластерина (clusterin) при системных АККЛ и ее отсутствие при кожных формах. Наличие кластерина не коррелирует с экспрессией АLК-белка, что характерно для экспрессии BCL-2 и с-Мус. Было установлено, что экспрессия BCL-2 возможна в основном при АLК-негативных вариантах, а ядерная экспрессия с-Мус, напротив, у АLК-позитивных анапластических крупноклеточных лимфом, что позволяет заключить, что наличие АLК-белка может оказывать влияние на индукцию апоптоза при АККЛ. Системные АККЛ имеют два главных иммунофенотипа: Т- и О-клеточный. Большинство случаев имеют Т-клеточное происхождение, что подтверждается экспрессией одного или нескольких Т-клеточных антигенов. АККЛ О-клеточного фенотипа, возможно, принадлежит к Т-клеточному фенотипу, так как опухолевые клетки обычно экспрессируют цитотоксические молекулы: перфорин, гранзим В (granzyme) и Т1А-1.

Кожная анапластическая крупноклеточная лимфома характеризуется Т-фенотипом, но при этом отличается от системной формы, так как всегда АLK-негативна и обычно не экспрессирует ЕМА и цитотоксические молекулы.

По данным мировой литературы, в 60-70% случаев АККЛ наблюдается t(2;5)(q23q35), которая вызывает слияние гена ALK хромосомы 2 с геном NPM (нуклеофозмин) хромосомы 5. Следует отметить, что при периферических лимфопролиферациях в отличие от случаев, наблюдаемых при острых лейкозах, хромосомная транслокация, ведущая к появлению гибридных генов, редка. Дикий тип NPM-гена отвечает за кодирование филогенетически-консервированного и повсеместно проявляемого 37 kDa кислотного фосфобелглавных аргирофильных нуклеолярных (ядрышковых) белков (AgNOR ядрышек). Основной функцией NPM является перенос только что синтезированных белков в ядрышко. Для выполнения этой функции необходимы домен олигоомеризации N-концевой области и два ядерных сигнала в С-конечной области.

Область ядрышковых организаторов (ОЯОР) представляет собой участок вторичных перетяжек акроцентрических хромосом, где локализованы гены, кодирующие рибосомную РНК (рРНК), и формируется ядрышко непосредственно после деления клетки. С ОЯОР ассоциированы кислые негистоновые аргирофильные белки, регулирующие процесс синтеза рРНК и образование рибосом. Среди аргирофильных белков ОЯОР наиболее охарактеризованы РНК-полимераза I, белки С23 (нуклеолин) и В23 (нуклеофозмин).

Аргирофильные свойства ассоциированных с областью ядрышковых организаторов кислых негистоновых белков используются при выявлении ОЯОР при помощи нитрата серебра. Образующиеся при этом гранулы серебра являются маркерами ОЯОР. Показано, что нитратом серебра выявляются транскрипционно активные ОЯОР, и в этой связи степень аргирофилии ядрышковых структур может рассматриваться как цитохимический эквивалент функциональной активности рибосомных генов. Аргирофильные белки играют важную роль в регуляции клеточного цикла, определяя его продолжительность. При исследовании различных опухолей было выявлено повышение содержания в них белков области ядрышковых организаторов по мере прогрессирования злокачественного процесса. При этом, как было показано экспериментальными исследованиями, наблюдаемое повышение содержания белков ОЯОР происходит не в результате синтеза новых белков этого класса, а в результате усиленного синтеза белков ОЯОР — С23 и В23. Эти результаты позволили рассматривать активность области ядрышковых организаторов как один из критериев разграничения доброкачественных и злокачественных новообразований, выявления опухолей высокой и низкой степени злокачественности, определения прогноза. ALK-ген дикого типа кодирует крупный, гликилизированный, 200 kDa трансмембранный рецептор, ближе всего связанный с Ltk (лейкоцитотирозинкиназа), для которого соответствующий лиганд до сих пор не установлен и его обычная функция не определена. Местонахождение ALK-гена дикого типа в нормальных тканях ограничено поверхностной мембраной и цитоплазмой. Внутрицитоплазматический конец ALK несет тирозинкиназа каталитической области, которая физиологически активируется в результате гомодимеризации и связывания лигандов. Как следствие t (2;5) часть гена NPM, кодирующая аминоконечную область NPM (аминокислоты 1-116), сливается с частью гена ALK, кодирующей всю цитоплазматическую область белка ALK (последние 563 аминокислоты ALK) (рис. 1). В результате ген ALK попадает под контроль промотера NPM, что в свою очередь ведет к перманентному и повсеместному считыванию кода гибридного NPM-ALK-гена и получению 80 kDа рекомбинантного белка, обозначаемого NPM-ALK, или р80 (рис. 1).

Рис. 1. Молекулярная структура нуклеофозмина (NPM), киназы анапластической лимфомы и гибридных форм ALK. Рекомбинантный белок NPM-ALK способен образовывать гомодимеры (путем перекрещивания с NPM дикого типа). Образование гомодимеров ведет к конституционной активации каталитической области ALK путем имитации рецепторной димеризации и активации. In vitro трансфекция NPM-ALK в клеточные линии мышей/крыс ведет к формированию трансформированного фенотипа. Мало известно о сигнальных путях, по которым NPM-ALK оказывает онкогенное действие.

Фосфолипаза С-у, по всей видимости, является важной мишенью для NPM-ALK. На самом деле этот гибридный белок может связываться in vitro с областями Sh3 фосфолипазы С-у, что ведет к ее тирозинфосфорилированию и активации с последующей трансдукцией митогенных сигналов. NPM-ALK, вероятно, связан с фосфатидилинозитом (PI-3K) и производит конститутивную активацию путей антиапоптозной PI-3-киназы/ALK.

Менее ясной представляется роль взаимодействий NPM-ALK и других сигнальных молекул, а именно STAT5 и внутриклеточной областью CD30. In vitro NPM-ALK также связывается с Shc и субстратом инсулинового рецептора (insulin receptor substate 1, IRS-1), но эти взаимодействия не являются необходимыми для трансформации. Наконец, полученные противоречивые сведения, которые свидетельствуют о прямой подаче сигнала от NPM-ALK к соединительному белку GRB2, но в то же время у NPM-ALK не было найдено области, отвечающей за распознавание GRB2. Онкогенные свойства NPM-ALK in vivo подтверждаются экспериментальными данными, показывающими, что инфузия мышиных гемопоэтических клеток с трансфекцией NPM-ALK ведет к развитию лимфом. В то же время эти мышиные лимфомы имеют В-клеточное происхождение и, очевидно, отличаются от ALK-положительной лимфомы, развивающейся у людей, Т- и О-типа. Эти данные наводят на мысль о том, что активация одного и того же тирозинкиназасигнального пути может, с одной стороны, носить онкогенный характер в различных типах клеток, а с другой — свидетельствовать о взаимодействии NPM-ALK с широким диапазоном опухолевых молекул.

Рис. 2. Молекулярные механизмы взаимодействия NPM-ALK.

Для обнаружения NPM-ALK транслокаций в тканевых срезах существует несколько методов: PCR, метод in situ гибридизации, флюоресцентная in situ гибридизация (FISH). Так как при использовании метода PCR возможны артефакты и его применение требует высококачественного RNA, а FISH занимает много времени, иммуногистохимическое исследование, с практической точки зрения, является наиболее удобным и широко используемым методом, так как оно имеет строго определенные показания и легкое исполнение, недорого и дает быстрый результат.

Более того, этот метод позволяет использовать архивный, залитый в парафин материал, что дает возможность судить о природе меченых клеток и архитектонике тканей, а также определять молекулярные варианты АККЛ, которые несут гибридные гены, отличные от NPM-ALK, и не распознаются с помощью PCR.

Поликлональные и с недавних пор крайне специфические моноклональные антитела, направленные против фиксатор-резистентных эпитопов цитоплазматической области ALK, т.е. антитела ALK1  и ALKc, а также антитела против N-концевой области NPM, стали доступными для оптимального иммуногистохимического (ИГХ)-распознавания этих белков в парафиновых срезах. В отличие от копий NPM-ALK и ATIC-ALK, распознающихся с помощью PCR даже в низком содержании в обычных и реактивных лимфоидных тканях, белок ALK не экспрессируется в нормальных тканях, за исключением некоторых клеток нейрогенного происхождения.

Поэтому присутствие ALK-белка при проведении ИГХ-анализа в тканях, отличных от тканей мозга, является свидетельством аномального проявления ALK, обычно в форме связанного с t(2;5) химерного белка NPM-ALK. ИГХ-свидетельство молекулярной связи распознанного ALK c NPM находится в субклеточном распределении белка ALK, который в случае t(2;5) можно увидеть не только в цитоплазме, но и в ядре. Около 15-20% ALK-позитивной AKKA дают неожиданный для t(2;5) ИГХ-рисунок в виде ограниченной цитоплазмой экспрессии ALK и ограниченной ядром экспрессии NPM (N-конец) (рис. 3). На основании этих результатов были высказаны предположения о существовании молекулярных вариантов AKKA, при которых в качестве партнера при слиянии с ALK выступает ген, отличный от NPM, и это приводит к возникновению иных гибридных белков ALK.

Рис. 3. Экспрессия различных гибридных белков ALK. Возможность того, что отличные от NPM гены могут вступать в контакт с геном ALK и приводить к появлению отличных от NPM-ALK рекомбинантных ALK-белков, была высказана в связи с наличием цитогенетических данных, показывающих, что при AKKA ген ALK 2p23 присутствует в генетических аномалиях, отличных от t(2;5), например t(1;2) (q21; p23), t(2;3)(p23q21) и инверсии (p23;q35). Более того, исследования с моноклональными антителами, направленными против ALK и N-концевой части NPM, установили наличие иных ALK белков с 85, 97, 104 и 113 kDa в некоторых случаях анапластической крупноклеточной лимфомы с «аномальным» субклеточным распределением ALK NPM, выявленном при ИГХ-анализе. При использовании ALK1 и ALKc моноклональных антител экспрессия химерных ALK-белков (или вариантов NPM-ALK) обнаружена приблизительно в 60-70% АККЛ. В связи с этим был предложен термин «ALK-позитивная АККЛ», или «ALKoma». В литературе чаще встречается название ALK-позитивной АККЛ, так как термин «ALKoma» может быть отнесен и к опухолям другой природы, характеризующихся наличием ALK-белка и его вариантов (миофибробластические опухоли у детей, редко — рабдомиосаркома, нейробластома, ALK-позитивные диффузные B-крупноклеточные лимфомы). В настоящее время нет убедительного ответа на вопрос, представляется ли ALK-негативный вариант AККЛ отдельной нозологической единицей или является подвариантом неспецифицированной периферической T-клеточной лимфомы. Ответ на этот вопрос может быть дан в результате детального изучения молекулярных механизмов лимфомагенеза. Для клинической практики патолог должен диагностировать анапластическую крупноклеточную лимфому согласно строгим критериям, описанным выше, определяя в каждом случае основное — является ли опухоль ALK-позитивным или ALK-негативным вариантом, поскольку высказываются мнения о прогностическом значении этого феномена.

ALK-позитивная АККЛ представляет собой широкий морфологический спектр — от мелкоклеточного до крупноклеточного варианта АККЛ. Ядерная ALK-экспрессия — признак транслокации (2;5) — мелких и крупных клеток опухоли является доказательством, что они принадлежат к одному и тому же неопластическому клону. В некоторых случаях трансформация мелкоклеточного варианта в анапластической крупноклеточной лимфоме классического типа связана с приобретением дополнительной хромосомной аномалии, вовлекающей половую хромосому и хромосомы 6, 7, 9 и 15.

И.В. Поддубная, А.А. Семенова, Н.А. Пробатова
Page 11

1201

Одной из основных черт анапластической крупноклеточной лимфомы (АККЛ) является экспрессия CD30 (КМ)-молекулы. CD30 является 120 kDa трансмембранным цитокиновым рецептором из семейства рецепторов фактора некроза опухоли TNF), для которого был установлен лиганд (CD30L). Растворимая 85 kDa-форма CD30 вырабатывается мембраносвязанной молекулой путем протеолитического распада и может быть обнаружена в больших концентрациях в сыворотке крови пациентов. В крупных анапластических опухолевых клетках экспрессия CD30 ограничена мембраной, цитоплазмой и точечной (гранулярной) реакцией (dot-like) в области аппарата Гольджи. В мелкоклеточном варианте только крупные анапластические клетки (чаще сосредоточенные около сосудов) проявляют положительную экспрессию CD30, в то время как мелкие опухолевые клетки чаще являются слабопозитивными или негативными на CD30. Воспроизводимость диагноза АККЛ по морфологическим признакам составляет 46% и может быть увеличена до 85% при иммунном окрашивании на CD30, и, тем не менее, именно иммунные реакции на CD30 должны всегда проводиться параллельно с определением наличия прочих лимфоидных и нелимфоидных маркеров, потому что экспрессия CD30 не является специфической чертой только АККЛ и наблюдается в нормальных активированных клетках других В- и Т-клеточных лимфоидных и нелимфоидных опухолей, а также при негемопоэтических злокачественных заболеваниях, некоторых карциномах и новообразованиях из герминогенных клеток. Однако при анапластической крупноклеточной лимфоме  характерным является выраженная, интенсивная реакция на CD30 в подавляющем большинстве клеток. Другие неоплазмы могут также характеризо-ваться положительной СР30-реакцией, но обычно менее интенсивной и гетерогенной.

Положительная экспрессия эпителиально-мембранного антигена (ЕМА) наблюдается более чем в 50% случаев АККЛ, хотя в некоторых случаях экспрессия положительна только в части опухолевых клеток. Опыт многих работ показал, что экспрессия EMA при АККЛ чаще наблюдается у детей и молодых пациентов и сочетается с благоприятным прогнозом.

В настоящее время ИВХ-реакцию на определение экспрессии ALK-белка принято считать наиболее специфичным диагностическим методом. Современная усовершенствованная генная технология продемонстрировала аномальную экспрессию кластерина (clusterin) при системных АККЛ и ее отсутствие при кожных формах. Наличие кластерина не коррелирует с экспрессией АLК-белка, что характерно для экспрессии BCL-2 и с-Мус. Было установлено, что экспрессия BCL-2 возможна в основном при АLК-негативных вариантах, а ядерная экспрессия с-Мус, напротив, у АLК-позитивных анапластических крупноклеточных лимфом, что позволяет заключить, что наличие АLК-белка может оказывать влияние на индукцию апоптоза при АККЛ. Системные АККЛ имеют два главных иммунофенотипа: Т- и О-клеточный. Большинство случаев имеют Т-клеточное происхождение, что подтверждается экспрессией одного или нескольких Т-клеточных антигенов. АККЛ О-клеточного фенотипа, возможно, принадлежит к Т-клеточному фенотипу, так как опухолевые клетки обычно экспрессируют цитотоксические молекулы: перфорин, гранзим В (granzyme) и Т1А-1.

Кожная анапластическая крупноклеточная лимфома характеризуется Т-фенотипом, но при этом отличается от системной формы, так как всегда АLK-негативна и обычно не экспрессирует ЕМА и цитотоксические молекулы.

По данным мировой литературы, в 60-70% случаев АККЛ наблюдается t(2;5)(q23q35), которая вызывает слияние гена ALK хромосомы 2 с геном NPM (нуклеофозмин) хромосомы 5. Следует отметить, что при периферических лимфопролиферациях в отличие от случаев, наблюдаемых при острых лейкозах, хромосомная транслокация, ведущая к появлению гибридных генов, редка. Дикий тип NPM-гена отвечает за кодирование филогенетически-консервированного и повсеместно проявляемого 37 kDa кислотного фосфобелглавных аргирофильных нуклеолярных (ядрышковых) белков (AgNOR ядрышек). Основной функцией NPM является перенос только что синтезированных белков в ядрышко. Для выполнения этой функции необходимы домен олигоомеризации N-концевой области и два ядерных сигнала в С-конечной области.

Область ядрышковых организаторов (ОЯОР) представляет собой участок вторичных перетяжек акроцентрических хромосом, где локализованы гены, кодирующие рибосомную РНК (рРНК), и формируется ядрышко непосредственно после деления клетки. С ОЯОР ассоциированы кислые негистоновые аргирофильные белки, регулирующие процесс синтеза рРНК и образование рибосом. Среди аргирофильных белков ОЯОР наиболее охарактеризованы РНК-полимераза I, белки С23 (нуклеолин) и В23 (нуклеофозмин).

Аргирофильные свойства ассоциированных с областью ядрышковых организаторов кислых негистоновых белков используются при выявлении ОЯОР при помощи нитрата серебра. Образующиеся при этом гранулы серебра являются маркерами ОЯОР. Показано, что нитратом серебра выявляются транскрипционно активные ОЯОР, и в этой связи степень аргирофилии ядрышковых структур может рассматриваться как цитохимический эквивалент функциональной активности рибосомных генов. Аргирофильные белки играют важную роль в регуляции клеточного цикла, определяя его продолжительность. При исследовании различных опухолей было выявлено повышение содержания в них белков области ядрышковых организаторов по мере прогрессирования злокачественного процесса. При этом, как было показано экспериментальными исследованиями, наблюдаемое повышение содержания белков ОЯОР происходит не в результате синтеза новых белков этого класса, а в результате усиленного синтеза белков ОЯОР — С23 и В23. Эти результаты позволили рассматривать активность области ядрышковых организаторов как один из критериев разграничения доброкачественных и злокачественных новообразований, выявления опухолей высокой и низкой степени злокачественности, определения прогноза. ALK-ген дикого типа кодирует крупный, гликилизированный, 200 kDa трансмембранный рецептор, ближе всего связанный с Ltk (лейкоцитотирозинкиназа), для которого соответствующий лиганд до сих пор не установлен и его обычная функция не определена. Местонахождение ALK-гена дикого типа в нормальных тканях ограничено поверхностной мембраной и цитоплазмой. Внутрицитоплазматический конец ALK несет тирозинкиназа каталитической области, которая физиологически активируется в результате гомодимеризации и связывания лигандов. Как следствие t (2;5) часть гена NPM, кодирующая аминоконечную область NPM (аминокислоты 1-116), сливается с частью гена ALK, кодирующей всю цитоплазматическую область белка ALK (последние 563 аминокислоты ALK) (рис. 1). В результате ген ALK попадает под контроль промотера NPM, что в свою очередь ведет к перманентному и повсеместному считыванию кода гибридного NPM-ALK-гена и получению 80 kDа рекомбинантного белка, обозначаемого NPM-ALK, или р80 (рис. 1).

Рис. 1. Молекулярная структура нуклеофозмина (NPM), киназы анапластической лимфомы и гибридных форм ALK. Рекомбинантный белок NPM-ALK способен образовывать гомодимеры (путем перекрещивания с NPM дикого типа). Образование гомодимеров ведет к конституционной активации каталитической области ALK путем имитации рецепторной димеризации и активации. In vitro трансфекция NPM-ALK в клеточные линии мышей/крыс ведет к формированию трансформированного фенотипа. Мало известно о сигнальных путях, по которым NPM-ALK оказывает онкогенное действие.

Фосфолипаза С-у, по всей видимости, является важной мишенью для NPM-ALK. На самом деле этот гибридный белок может связываться in vitro с областями Sh3 фосфолипазы С-у, что ведет к ее тирозинфосфорилированию и активации с последующей трансдукцией митогенных сигналов. NPM-ALK, вероятно, связан с фосфатидилинозитом (PI-3K) и производит конститутивную активацию путей антиапоптозной PI-3-киназы/ALK.

Менее ясной представляется роль взаимодействий NPM-ALK и других сигнальных молекул, а именно STAT5 и внутриклеточной областью CD30. In vitro NPM-ALK также связывается с Shc и субстратом инсулинового рецептора (insulin receptor substate 1, IRS-1), но эти взаимодействия не являются необходимыми для трансформации. Наконец, полученные противоречивые сведения, которые свидетельствуют о прямой подаче сигнала от NPM-ALK к соединительному белку GRB2, но в то же время у NPM-ALK не было найдено области, отвечающей за распознавание GRB2. Онкогенные свойства NPM-ALK in vivo подтверждаются экспериментальными данными, показывающими, что инфузия мышиных гемопоэтических клеток с трансфекцией NPM-ALK ведет к развитию лимфом. В то же время эти мышиные лимфомы имеют В-клеточное происхождение и, очевидно, отличаются от ALK-положительной лимфомы, развивающейся у людей, Т- и О-типа. Эти данные наводят на мысль о том, что активация одного и того же тирозинкиназасигнального пути может, с одной стороны, носить онкогенный характер в различных типах клеток, а с другой — свидетельствовать о взаимодействии NPM-ALK с широким диапазоном опухолевых молекул.

Рис. 2. Молекулярные механизмы взаимодействия NPM-ALK.

Для обнаружения NPM-ALK транслокаций в тканевых срезах существует несколько методов: PCR, метод in situ гибридизации, флюоресцентная in situ гибридизация (FISH). Так как при использовании метода PCR возможны артефакты и его применение требует высококачественного RNA, а FISH занимает много времени, иммуногистохимическое исследование, с практической точки зрения, является наиболее удобным и широко используемым методом, так как оно имеет строго определенные показания и легкое исполнение, недорого и дает быстрый результат.

Более того, этот метод позволяет использовать архивный, залитый в парафин материал, что дает возможность судить о природе меченых клеток и архитектонике тканей, а также определять молекулярные варианты АККЛ, которые несут гибридные гены, отличные от NPM-ALK, и не распознаются с помощью PCR.

Поликлональные и с недавних пор крайне специфические моноклональные антитела, направленные против фиксатор-резистентных эпитопов цитоплазматической области ALK, т.е. антитела ALK1  и ALKc, а также антитела против N-концевой области NPM, стали доступными для оптимального иммуногистохимического (ИГХ)-распознавания этих белков в парафиновых срезах. В отличие от копий NPM-ALK и ATIC-ALK, распознающихся с помощью PCR даже в низком содержании в обычных и реактивных лимфоидных тканях, белок ALK не экспрессируется в нормальных тканях, за исключением некоторых клеток нейрогенного происхождения.

Поэтому присутствие ALK-белка при проведении ИГХ-анализа в тканях, отличных от тканей мозга, является свидетельством аномального проявления ALK, обычно в форме связанного с t(2;5) химерного белка NPM-ALK. ИГХ-свидетельство молекулярной связи распознанного ALK c NPM находится в субклеточном распределении белка ALK, который в случае t(2;5) можно увидеть не только в цитоплазме, но и в ядре. Около 15-20% ALK-позитивной AKKA дают неожиданный для t(2;5) ИГХ-рисунок в виде ограниченной цитоплазмой экспрессии ALK и ограниченной ядром экспрессии NPM (N-конец) (рис. 3). На основании этих результатов были высказаны предположения о существовании молекулярных вариантов AKKA, при которых в качестве партнера при слиянии с ALK выступает ген, отличный от NPM, и это приводит к возникновению иных гибридных белков ALK.

Рис. 3. Экспрессия различных гибридных белков ALK. Возможность того, что отличные от NPM гены могут вступать в контакт с геном ALK и приводить к появлению отличных от NPM-ALK рекомбинантных ALK-белков, была высказана в связи с наличием цитогенетических данных, показывающих, что при AKKA ген ALK 2p23 присутствует в генетических аномалиях, отличных от t(2;5), например t(1;2) (q21; p23), t(2;3)(p23q21) и инверсии (p23;q35). Более того, исследования с моноклональными антителами, направленными против ALK и N-концевой части NPM, установили наличие иных ALK белков с 85, 97, 104 и 113 kDa в некоторых случаях анапластической крупноклеточной лимфомы с «аномальным» субклеточным распределением ALK NPM, выявленном при ИГХ-анализе. При использовании ALK1 и ALKc моноклональных антител экспрессия химерных ALK-белков (или вариантов NPM-ALK) обнаружена приблизительно в 60-70% АККЛ. В связи с этим был предложен термин «ALK-позитивная АККЛ», или «ALKoma». В литературе чаще встречается название ALK-позитивной АККЛ, так как термин «ALKoma» может быть отнесен и к опухолям другой природы, характеризующихся наличием ALK-белка и его вариантов (миофибробластические опухоли у детей, редко — рабдомиосаркома, нейробластома, ALK-позитивные диффузные B-крупноклеточные лимфомы). В настоящее время нет убедительного ответа на вопрос, представляется ли ALK-негативный вариант AККЛ отдельной нозологической единицей или является подвариантом неспецифицированной периферической T-клеточной лимфомы. Ответ на этот вопрос может быть дан в результате детального изучения молекулярных механизмов лимфомагенеза. Для клинической практики патолог должен диагностировать анапластическую крупноклеточную лимфому согласно строгим критериям, описанным выше, определяя в каждом случае основное — является ли опухоль ALK-позитивным или ALK-негативным вариантом, поскольку высказываются мнения о прогностическом значении этого феномена.

ALK-позитивная АККЛ представляет собой широкий морфологический спектр — от мелкоклеточного до крупноклеточного варианта АККЛ. Ядерная ALK-экспрессия — признак транслокации (2;5) — мелких и крупных клеток опухоли является доказательством, что они принадлежат к одному и тому же неопластическому клону. В некоторых случаях трансформация мелкоклеточного варианта в анапластической крупноклеточной лимфоме классического типа связана с приобретением дополнительной хромосомной аномалии, вовлекающей половую хромосому и хромосомы 6, 7, 9 и 15.

И.В. Поддубная, А.А. Семенова, Н.А. Пробатова

medbe.ru

Варианты иммунофенотипа рака молочной железы и их клиническое значение для прогноза

Главная / Материалы медицинских конференций / 2003 / VΙΙ Российская онкологическая конференция

В.П. Летягин, Н.Н. Тупицын, Е.В. Артамонова. РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва

Во всем мире с каждым годом констатируют увеличение числа регистрируемых случаев рака молочной железы. При таком развитии в ХХI веке возникает высокая вероятность появления на планете более 1000.000 заболевших раком этой локализации. Так, в США в 1998 г. зарегистрировано 180.300 новых случаев рака молочной железы и 43.900 летальных исходов этого заболевания. В 2000 г. в России заболели 44.800 женщин. Средний возраст заболевших составил 55-74 года. За 2000 г. в России от рака молочной железы умерли 21.994 человек, причем показатели смертности и заболеваемости имеют тенденцию к росту (Давыдов М.И., Аксель Е.М., 2002).

В структуре научных изысканий опухолей молочной железы большое место занимают иммунологические исследования. Они ведутся по двум направлениям: изучение иммунофенотипа опухоли и изучение противоопухолевого иммунитета.

Исследования в этом направлении стали широко проводиться с внедрением в клиническую практику моноклональных антител (МКА) как к лейкоцитарным молекулам, так и к антигенам и рецепторам, специфичным для эпителиальных клеток (2, 3, 4, 5).

Иммунофенотип рака молочной железы был изучен у 239 больных с помощью панели МКА. Мы оценили экспрессию злокачественными клетками эпителиальных антигенов (Egp34, MUC-1, РЭА), молекул главного комплекса гистосовместимости I и II классов и антигенов кластеров лейкоцитарной дифференцировки (сюда вошли рецепторы трансферрина CD71 и молекулы адгезии CD29), которые играют определенную роль в регуляции процессов опухолевого роста.

Иммуногистохимическое исследование первичных опухолей проведено на криостатных срезах 239 опухолей молочных желез, полученных в ходе операции (230 больных) и с помощью трепанбиопсий (9 больных).

Основную часть (171 чел. - 71,5%) составили больные с инфильтрирующим протоковым раком, инфильтрирующий дольковый рак отмечен у 22 (9,2%) пациенток, смешанный – у 21 (8,8%) женщины, а остальные больные (25 – 10,5%) имели редкие формы. Консервативное лечение (химиолучевое) проведено 9 больным с IV стадией. Хирургическое лечение получили 116 (50,4%) пациенток. Комплексная терапия проведена 36 (15,7%), а комбинированная – 78 (33,9%) больным.

Результаты нашего исследования позволили выделить два типа гетерогенности экспрессии маркеров: в группе «рак молочной железы» и в пределах одного случая.

Общеэпителиальный антиген Egp34 отличается мономорфностью экспрессии при раке молочной железы. Этот маркер выявляется в 100% случаев рака молочной железы и отличается исключительно высокой частотой мономорфных реакций (98,7%), что позволяет успешно локализовать все опухолевые зоны в препарате для их дальнейшего детального изучения с помощью других МКА.

С другой стороны, Egp34 отсутствует на клетках неэпителиального происхождения, что позволяет использовать МКА НЕА-125 для дифференциальной диагностики недифференцированных опухолей эпителиального и неэпителиального происхождения, а также для иммуноморфологического выявления микрометастазов рака молочной железы в регионарные лимфоузлы и костный мозг. Применение МКА НЕА-125 к Egp34 позволило увеличить частоту выявления метастазов на 6,8% по сравнению с морфологическим исследованием.

Вторым изученным нами маркером был муциноподобный антиген MUC-1. Он также часто (в 94,0% случаев) выявлялся при раке молочной железы, однако гораздо реже, чем Egp34, отличался мономорфным типом реакции (МКА ICO-25 реагировал с большинством опухолевых клеток лишь в 56,3% наблюдений).

При оценке взаимосвязи экспрессии различных антигенов клетками рака молочной железы мы обнаружили значимую положительную корреляцию между муциноподобным антигеном MUC-1 и РЭА. Все 100% опухолей, мономорфно экспрессирующих РЭА, также мономорфно экспрессировали MUC-1. Вероятно, появление РЭА-положительных и MUC-1-положительных фенотипов взаимосвязано между собой, является отражением злокачественной трансформации и связанных с ней процессов анаплазии и дедифференцировки и может оказаться фактором неблагоприятного прогноза заболевания.

Применение МКА ICO-25 для исследования регионарных лимфоузлов у больных раком молочной железы с N0 позволило увеличить частоту выявления метастазов на 8,3% по сравнению с гистологическим исследованием, поэтому иммуногистохимическое исследование регионарных лимфоузлов с МКА ICO-25 целесообразно проводить в дополнение к стандартному гистологическому исследованию у больных раком молочной железы группы N0, что совпадает с мнением других авторов (6, 7, 8, 9).

Показатель общей 5-летней выживаемости составил при отсутствии MUC-1 на опухолевых клетках 75,0±21,6%; при мозаичной экспрессии – 74,8±5,9% и в группе мономорфной экспрессией – 67,0±5,4%.

Третьим эпителиальным маркером, оцененным нами при раке молочной железы, был раково-эмбриональный антиген (РЭА). Он характеризуется гетерогенностью экспрессии, как в нозологической группе, так и в пределах одного случая и наиболее редко, по сравнению с Egp34 и MUC-1, выявляется на клетках первичной опухоли (29,5% случаев).

При исследовании местных иммунных реакций в группах с РЭА-мономорфным, мозаичным и отрицательным фенотипом выяснилось, что экспрессия РЭА приводила к достоверному снижению инфильтрации опухоли CD7+ T-лимфоцитами, что отражалось и на снижении общего уровня инфильтрации опухоли лимфоцитами, оцененного по общелейкоцитарному антигену CD45.

Наличие РЭА на клетках рака молочной железы вызывало достоверное увеличение частоты метастатического поражения регионарных лимфоузлов независимо от количества антигенположительных клеток (мономорфная и мозаичная реакция) (10).

При отсутствии антигена общая 5-летняя выживаемость составила 83,2±4,5%, при мозаичной реакции – 79,7±10,9% и мономорфной – 52,4±14,4%.

В целом частота обнаружения метастазов в регионарные лимфоузлы методом иммуногистохимии по совокупному показателю, достигнутому на основании применения трех МКА к эпителиальным антигенам (НЕА-125, НЕА-19 и ICO-25), была на 13,5% выше, чем при гистологическом исследовании.

Комплекс МКА (НЕА-125, НЕА-19 и ICO-25) оказался пригодным и для обнаружения раковых клеток в стернальном пунктате больных раком молочной железы.

Исследование антигенов главного комплекса гистосовместимости показало, что экспрессия HLA-I класса определяется в 56,5% случаев рака молочной железы; в 32,3% наблюдений отмечена мономорфная реакция; в 24,0% - мозаичная, а 43,8% случаев были полностью антиген-негативными.

Антигенный профиль опухолевых клеток существенно отличается от нормальной ткани молочной железы. Фенотип нормальных эпителиальных клеток во всех случаях соответствует HLA-I+ HLA-DR-. При раке молочной железы подобный нормальный фенотип наблюдался лишь в 18,1% наблюдений, а чаще всего рак молочной железы характеризовался полным отсутствием антигенов главного комплекса гистосовместимости на опухолевых клетках (41,4%).

Экспрессия HLA-I также статистически значимо положительно коррелировала с выявлением на опухолевых клетках молекул адгезии (CD29). В норме на эпителии молочной железы молекулы VLA-? экспрессированы во всех случаях и, следовательно, их утрата может являться косвенным отражением нарушения механизмов адгезии и связанной с этим активизацией процессов инвазии и метастазирования.

При исследовании HLA-I показатели 5-летней общей выживаемости существенно не отличались и составили при HLA-I(-) – 73,3±5,9%, при HLA-I(±) – 78,4±7,4% и при HLA-I(+) – 73,5±7,0%.

Проведенное исследование HLA-II класса показало, что при отсутствии экспрессии 5-летняя общая выживаемость составила 77,8±4,2%, при мозаичной – 81,7±7,4% и мономорфной – 58,8±12,1%.

Изучение местных иммунных реакций в группах с HLA-I положительным, мозаичным и негативным фенотипами установлено, что экспрессия молекул I класса статистически значимо коррелирует с увеличением инфильтрации опухоли T-лимфоцитами (CD5+, CD7+), их субпопуляциями (CD4+, CD8+) и макрофагами (CD163+), что отражается на увеличении общего уровня лейкоцитарной инфильтрации, оцененного по CD45. Молекулы HLA-I не влияют на реакцию В-лимфоцитов (CD19+, CD37+) и плазматических клеток (CD38+).

При изучении местных иммунных реакций в группах с HLA-DR положительным, мозаичным и негативным фенотипами установлено, что экспрессия молекул II класса при раке молочной железы статистически значимо коррелирует с увеличением инфильтрации опухоли по большинству субпопуляций иммунокомпетентных клеток. Отмечена положительная связь с общим уровнем лейкоцитарной инфильтрации (CD45+), реакцией CD7+ T-лимфоцитов и их субпопуляций (CD4+, CD8+), макрофагов (CD163+), CD19+ и CD37+ В-лимфоцитов и CD38+ плазматических клеток.

Таким образом, в целом экспрессия антигенов главного комплекса гистосовместимости клетками рака молочной железы была ассоциирована с увеличением степени выраженности местных иммунных реакций (11).

Особый интерес клиницистов должны вызвать данные, полученные нами при изучении рецептора трансферрина (CD71). Маркер CD71 обнаруживался сравнительно часто: в 75,7% случаев рака молочной железы. Мономорфная экспрессия отмечена в 53,7% наблюдений, мозаичная – в 22,0%. Только 24,4% опухолей были полностью антиген-негативными. CD71 не был достоверно взаимосвязан с другими изученными маркерами.

При отсутствии этого маркера на раковых клетках регионарные лимфоузлы статистически значимо чаще оставались интактными (N0). Напротив, экспрессия CD71, независимо от количества антигенположительных клеток, приводила к достоверному увеличению частоты метастатического поражения регионарных лимфоузлов.

При отсутствии экспрессии общая 5-летняя выживаемость составила 96,4±3,5%, при мозаичном варианте – 63,9±10,4% и мономорфном – 69,1±7,5%.

Особое значение приобретает тот факт, что экспрессия CD71 оказывает неблагоприятное прогностическое влияние при ранних (I и IIa) стадиях рака молочной железы: прогрессирование в этой группе больных наблюдалось нами только при наличии на мембране злокачественных клеток рецепторов трансферрина. Очевидно, что эта категория пациенток нуждается в пристальном внимании клиницистов с позиции возможной целесообразности адъювантной терапии при ранних (N0) стадиях рака молочной железы.

Изучение взаимосвязи иммунной реакции со степенью распространенности рака молочной железы позволило вскрыть ряд очень важных закономерностей: с уменьшением общего уровня лейкоцитарной инфильтрации (CD45+), достоверно увеличивалась частота метастатического поражения регионарных лимфоузлов. Выявление отдаленных метастазов также достоверно отрицательно коррелировало с общим уровнем иммунного ответа (CD45+). Выраженный общий уровень местной иммунной реакции, оцененный по CD45, может служить самостоятельным фактором благоприятного прогноза у больных раком молочной железы.

Определение CD45 показало, что при слабой реакции общая 5-летняя выживаемость составила 61,4±9,3%; при умеренной – 72,7±7,0% и при выраженной – 77,9±5,3%.

Выраженная и умеренная реакция CD7+ Т-лимфоцитов отмечалась сравнительно редко: в 17,3% и в 32,7% случаев соответственно, а преобладал слабый тип реакции – 50,0% наблюдений.

Аналогичная тенденция отмечена и для субпопуляций Т-лимфоцитов. Выраженная, умеренная и слабая реакция CD4+ клеток отмечена в 14,2%; 29,1% и 56,7% случаев соответственно, CD8+ клеток – в 14,9%; 30,6% и 54,5% случаев соответственно.

Общая 5-летняя выживаемость при выраженной реакции на CD7 составила 74,1±8,0%; умеренной – 58,4±7,3% и слабой – 58,4±5,6%.

При исследовании CD8 выявлено, что при выраженной реакции общая 5-летняя выживаемость составила 88,9±7,4%, а при слабой – 57,2±7,3%;при исследовании CD4 показатель 5-летней общей выживаемости составил при выраженной реакции 88,2±7,8%, умеренной – 77,6±7,5% и слабой – 63,3±6,9%.

Изучение взаимосвязей между различными иммунокомпетентными клетками показало, что реакция Т-лимфоцитов и их субпопуляций (CD4+ и CD8+) высоко достоверно коррелировали между собой, а так же с реакцией В-лимфоцитов (CD19+ и CD37+), CD38+ лимфоцитов и плазматических клеток и макрофагов (CD163). Общий уровень иммунной реакции, оцененный по CD45, также высоко достоверно коррелировал с инфильтрацией опухоли Т-лимфоцитами и их субпопуляциями и зависел от последних.

Инфильтрация опухоли CD7+ Т-лимфоцитами и их субпопуляциями (CD 4+ и CD 8+) достоверно отрицательно коррелировала с величиной первичной опухоли.

С уменьшением реакции CD 4+ Т-хелперов/индукторов и CD8+ супрессоров/цитотоксических клеток достоверно увеличивалась частота обнаружения метастазов в регионарные лимфоузлы.

Частота выявления отдаленных метастазов также достоверно отрицательно коррелировала с инфильтрацией опухоли субпопуляцией CD8+ Т-лимфоцитов.

Стадия заболевания достоверно отрицательно коррелировала с реакцией CD8+ супрессоров/цитотоксических клеток.

Таким образом, исследование иммунофенотипа рака молочной железы является необходимым дополнением, позволяющим более четко определить прогноз заболевания и на этом основании выработать оптимальную тактику лечения и наблюдения за больной.

www.mosmedclinic.ru

Варианты иммунофенотипа рака молочной железы и их клиническое значение для прогноза

Главная / Материалы медицинских конференций / 2004 / VΙΙ Российская онкологическая конференция

В.П. Летягин, Н.Н. Тупицын, Е.В. Артамонова. РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва

Во всем мире с каждым годом констатируют увеличение числа регистрируемых случаев рака молочной железы. При таком развитии в ХХI веке возникает высокая вероятность появления на планете более 1000.000 заболевших раком этой локализации. Так, в США в 1998 г. зарегистрировано 180.300 новых случаев рака молочной железы и 43.900 летальных исходов этого заболевания. В 2000 г. в России заболели 44.800 женщин. Средний возраст заболевших составил 55-74 года. За 2000 г. в России от рака молочной железы умерли 21.994 человек, причем показатели смертности и заболеваемости имеют тенденцию к росту (Давыдов М.И., Аксель Е.М., 2002).

В структуре научных изысканий опухолей молочной железы большое место занимают иммунологические исследования. Они ведутся по двум направлениям: изучение иммунофенотипа опухоли и изучение противоопухолевого иммунитета.

Исследования в этом направлении стали широко проводиться с внедрением в клиническую практику моноклональных антител (МКА) как к лейкоцитарным молекулам, так и к антигенам и рецепторам, специфичным для эпителиальных клеток (2, 3, 4, 5).

Иммунофенотип рака молочной железы был изучен у 239 больных с помощью панели МКА. Мы оценили экспрессию злокачественными клетками эпителиальных антигенов (Egp34, MUC-1, РЭА), молекул главного комплекса гистосовместимости I и II классов и антигенов кластеров лейкоцитарной дифференцировки (сюда вошли рецепторы трансферрина CD71 и молекулы адгезии CD29), которые играют определенную роль в регуляции процессов опухолевого роста.

Иммуногистохимическое исследование первичных опухолей проведено на криостатных срезах 239 опухолей молочных желез, полученных в ходе операции (230 больных) и с помощью трепанбиопсий (9 больных).

Основную часть (171 чел. - 71,5%) составили больные с инфильтрирующим протоковым раком, инфильтрирующий дольковый рак отмечен у 22 (9,2%) пациенток, смешанный – у 21 (8,8%) женщины, а остальные больные (25 – 10,5%) имели редкие формы. Консервативное лечение (химиолучевое) проведено 9 больным с IV стадией. Хирургическое лечение получили 116 (50,4%) пациенток. Комплексная терапия проведена 36 (15,7%), а комбинированная – 78 (33,9%) больным.

Результаты нашего исследования позволили выделить два типа гетерогенности экспрессии маркеров: в группе «рак молочной железы» и в пределах одного случая.

Общеэпителиальный антиген Egp34 отличается мономорфностью экспрессии при раке молочной железы. Этот маркер выявляется в 100% случаев рака молочной железы и отличается исключительно высокой частотой мономорфных реакций (98,7%), что позволяет успешно локализовать все опухолевые зоны в препарате для их дальнейшего детального изучения с помощью других МКА.

С другой стороны, Egp34 отсутствует на клетках неэпителиального происхождения, что позволяет использовать МКА НЕА-125 для дифференциальной диагностики недифференцированных опухолей эпителиального и неэпителиального происхождения, а также для иммуноморфологического выявления микрометастазов рака молочной железы в регионарные лимфоузлы и костный мозг. Применение МКА НЕА-125 к Egp34 позволило увеличить частоту выявления метастазов на 6,8% по сравнению с морфологическим исследованием.

Вторым изученным нами маркером был муциноподобный антиген MUC-1. Он также часто (в 94,0% случаев) выявлялся при раке молочной железы, однако гораздо реже, чем Egp34, отличался мономорфным типом реакции (МКА ICO-25 реагировал с большинством опухолевых клеток лишь в 56,3% наблюдений).

При оценке взаимосвязи экспрессии различных антигенов клетками рака молочной железы мы обнаружили значимую положительную корреляцию между муциноподобным антигеном MUC-1 и РЭА. Все 100% опухолей, мономорфно экспрессирующих РЭА, также мономорфно экспрессировали MUC-1. Вероятно, появление РЭА-положительных и MUC-1-положительных фенотипов взаимосвязано между собой, является отражением злокачественной трансформации и связанных с ней процессов анаплазии и дедифференцировки и может оказаться фактором неблагоприятного прогноза заболевания.

Применение МКА ICO-25 для исследования регионарных лимфоузлов у больных раком молочной железы с N0 позволило увеличить частоту выявления метастазов на 8,3% по сравнению с гистологическим исследованием, поэтому иммуногистохимическое исследование регионарных лимфоузлов с МКА ICO-25 целесообразно проводить в дополнение к стандартному гистологическому исследованию у больных раком молочной железы группы N0, что совпадает с мнением других авторов (6, 7, 8, 9).

Показатель общей 5-летней выживаемости составил при отсутствии MUC-1 на опухолевых клетках 75,0±21,6%; при мозаичной экспрессии – 74,8±5,9% и в группе мономорфной экспрессией – 67,0±5,4%.

Третьим эпителиальным маркером, оцененным нами при раке молочной железы, был раково-эмбриональный антиген (РЭА). Он характеризуется гетерогенностью экспрессии, как в нозологической группе, так и в пределах одного случая и наиболее редко, по сравнению с Egp34 и MUC-1, выявляется на клетках первичной опухоли (29,5% случаев).

При исследовании местных иммунных реакций в группах с РЭА-мономорфным, мозаичным и отрицательным фенотипом выяснилось, что экспрессия РЭА приводила к достоверному снижению инфильтрации опухоли CD7+ T-лимфоцитами, что отражалось и на снижении общего уровня инфильтрации опухоли лимфоцитами, оцененного по общелейкоцитарному антигену CD45.

Наличие РЭА на клетках рака молочной железы вызывало достоверное увеличение частоты метастатического поражения регионарных лимфоузлов независимо от количества антигенположительных клеток (мономорфная и мозаичная реакция) (10).

При отсутствии антигена общая 5-летняя выживаемость составила 83,2±4,5%, при мозаичной реакции – 79,7±10,9% и мономорфной – 52,4±14,4%.

В целом частота обнаружения метастазов в регионарные лимфоузлы методом иммуногистохимии по совокупному показателю, достигнутому на основании применения трех МКА к эпителиальным антигенам (НЕА-125, НЕА-19 и ICO-25), была на 13,5% выше, чем при гистологическом исследовании.

Комплекс МКА (НЕА-125, НЕА-19 и ICO-25) оказался пригодным и для обнаружения раковых клеток в стернальном пунктате больных раком молочной железы.

Исследование антигенов главного комплекса гистосовместимости показало, что экспрессия HLA-I класса определяется в 56,5% случаев рака молочной железы; в 32,3% наблюдений отмечена мономорфная реакция; в 24,0% - мозаичная, а 43,8% случаев были полностью антиген-негативными.

Антигенный профиль опухолевых клеток существенно отличается от нормальной ткани молочной железы. Фенотип нормальных эпителиальных клеток во всех случаях соответствует HLA-I+ HLA-DR-. При раке молочной железы подобный нормальный фенотип наблюдался лишь в 18,1% наблюдений, а чаще всего рак молочной железы характеризовался полным отсутствием антигенов главного комплекса гистосовместимости на опухолевых клетках (41,4%).

Экспрессия HLA-I также статистически значимо положительно коррелировала с выявлением на опухолевых клетках молекул адгезии (CD29). В норме на эпителии молочной железы молекулы VLA-? экспрессированы во всех случаях и, следовательно, их утрата может являться косвенным отражением нарушения механизмов адгезии и связанной с этим активизацией процессов инвазии и метастазирования.

При исследовании HLA-I показатели 5-летней общей выживаемости существенно не отличались и составили при HLA-I(-) – 73,3±5,9%, при HLA-I(±) – 78,4±7,4% и при HLA-I(+) – 73,5±7,0%.

Проведенное исследование HLA-II класса показало, что при отсутствии экспрессии 5-летняя общая выживаемость составила 77,8±4,2%, при мозаичной – 81,7±7,4% и мономорфной – 58,8±12,1%.

Изучение местных иммунных реакций в группах с HLA-I положительным, мозаичным и негативным фенотипами установлено, что экспрессия молекул I класса статистически значимо коррелирует с увеличением инфильтрации опухоли T-лимфоцитами (CD5+, CD7+), их субпопуляциями (CD4+, CD8+) и макрофагами (CD163+), что отражается на увеличении общего уровня лейкоцитарной инфильтрации, оцененного по CD45. Молекулы HLA-I не влияют на реакцию В-лимфоцитов (CD19+, CD37+) и плазматических клеток (CD38+).

При изучении местных иммунных реакций в группах с HLA-DR положительным, мозаичным и негативным фенотипами установлено, что экспрессия молекул II класса при раке молочной железы статистически значимо коррелирует с увеличением инфильтрации опухоли по большинству субпопуляций иммунокомпетентных клеток. Отмечена положительная связь с общим уровнем лейкоцитарной инфильтрации (CD45+), реакцией CD7+ T-лимфоцитов и их субпопуляций (CD4+, CD8+), макрофагов (CD163+), CD19+ и CD37+ В-лимфоцитов и CD38+ плазматических клеток.

Таким образом, в целом экспрессия антигенов главного комплекса гистосовместимости клетками рака молочной железы была ассоциирована с увеличением степени выраженности местных иммунных реакций (11).

Особый интерес клиницистов должны вызвать данные, полученные нами при изучении рецептора трансферрина (CD71). Маркер CD71 обнаруживался сравнительно часто: в 75,7% случаев рака молочной железы. Мономорфная экспрессия отмечена в 53,7% наблюдений, мозаичная – в 22,0%. Только 24,4% опухолей были полностью антиген-негативными. CD71 не был достоверно взаимосвязан с другими изученными маркерами.

При отсутствии этого маркера на раковых клетках регионарные лимфоузлы статистически значимо чаще оставались интактными (N0). Напротив, экспрессия CD71, независимо от количества антигенположительных клеток, приводила к достоверному увеличению частоты метастатического поражения регионарных лимфоузлов.

При отсутствии экспрессии общая 5-летняя выживаемость составила 96,4±3,5%, при мозаичном варианте – 63,9±10,4% и мономорфном – 69,1±7,5%.

Особое значение приобретает тот факт, что экспрессия CD71 оказывает неблагоприятное прогностическое влияние при ранних (I и IIa) стадиях рака молочной железы: прогрессирование в этой группе больных наблюдалось нами только при наличии на мембране злокачественных клеток рецепторов трансферрина. Очевидно, что эта категория пациенток нуждается в пристальном внимании клиницистов с позиции возможной целесообразности адъювантной терапии при ранних (N0) стадиях рака молочной железы.

Изучение взаимосвязи иммунной реакции со степенью распространенности рака молочной железы позволило вскрыть ряд очень важных закономерностей: с уменьшением общего уровня лейкоцитарной инфильтрации (CD45+), достоверно увеличивалась частота метастатического поражения регионарных лимфоузлов. Выявление отдаленных метастазов также достоверно отрицательно коррелировало с общим уровнем иммунного ответа (CD45+). Выраженный общий уровень местной иммунной реакции, оцененный по CD45, может служить самостоятельным фактором благоприятного прогноза у больных раком молочной железы.

Определение CD45 показало, что при слабой реакции общая 5-летняя выживаемость составила 61,4±9,3%; при умеренной – 72,7±7,0% и при выраженной – 77,9±5,3%.

Выраженная и умеренная реакция CD7+ Т-лимфоцитов отмечалась сравнительно редко: в 17,3% и в 32,7% случаев соответственно, а преобладал слабый тип реакции – 50,0% наблюдений.

Аналогичная тенденция отмечена и для субпопуляций Т-лимфоцитов. Выраженная, умеренная и слабая реакция CD4+ клеток отмечена в 14,2%; 29,1% и 56,7% случаев соответственно, CD8+ клеток – в 14,9%; 30,6% и 54,5% случаев соответственно.

Общая 5-летняя выживаемость при выраженной реакции на CD7 составила 74,1±8,0%; умеренной – 58,4±7,3% и слабой – 58,4±5,6%.

При исследовании CD8 выявлено, что при выраженной реакции общая 5-летняя выживаемость составила 88,9±7,4%, а при слабой – 57,2±7,3%;при исследовании CD4 показатель 5-летней общей выживаемости составил при выраженной реакции 88,2±7,8%, умеренной – 77,6±7,5% и слабой – 63,3±6,9%.

Изучение взаимосвязей между различными иммунокомпетентными клетками показало, что реакция Т-лимфоцитов и их субпопуляций (CD4+ и CD8+) высоко достоверно коррелировали между собой, а так же с реакцией В-лимфоцитов (CD19+ и CD37+), CD38+ лимфоцитов и плазматических клеток и макрофагов (CD163). Общий уровень иммунной реакции, оцененный по CD45, также высоко достоверно коррелировал с инфильтрацией опухоли Т-лимфоцитами и их субпопуляциями и зависел от последних.

Инфильтрация опухоли CD7+ Т-лимфоцитами и их субпопуляциями (CD 4+ и CD 8+) достоверно отрицательно коррелировала с величиной первичной опухоли.

С уменьшением реакции CD 4+ Т-хелперов/индукторов и CD8+ супрессоров/цитотоксических клеток достоверно увеличивалась частота обнаружения метастазов в регионарные лимфоузлы.

Частота выявления отдаленных метастазов также достоверно отрицательно коррелировала с инфильтрацией опухоли субпопуляцией CD8+ Т-лимфоцитов.

Стадия заболевания достоверно отрицательно коррелировала с реакцией CD8+ супрессоров/цитотоксических клеток.

Таким образом, исследование иммунофенотипа рака молочной железы является необходимым дополнением, позволяющим более четко определить прогноз заболевания и на этом основании выработать оптимальную тактику лечения и наблюдения за больной.

www.mosmedclinic.ru

КЛАССИФИКАЦИЯ ЛИМФОМ. МОРФОЛОГИЯ, ИММУНОФЕНОТИП, МОЛЕКУЛЯРНАЯ ГЕНЕТИКА НЕХОДЖКИНСКИХ ЛИМФОМ - PDF

1 , 2004 г. УДК Санкт-Петербургская медицинская академия последипломного образования КЛАССИФИКАЦИЯ ЛИМФОМ. МОРФОЛОГИЯ, ИММУНОФЕНОТИП, МОЛЕКУЛЯРНАЯ ГЕНЕТИКА НЕХОДЖКИНСКИХ ЛИМФОМ Клиническая характеристика опухолевого процесса (в первую очередь, локализация) могут иметь ключевое значение в дифференциальной диагностике, поскольку не только морфологические признаки лимфом, но и иммунофенотип опухолевых клеток неспецифичны, а молекулярногенетический анализ невозможен из-за разрушения ДНК при гистологической обработке биопсированной ткани или недоступен. Клиническая практика требует точного нозологического диагноза опухолей лимфоидной ткани на основании интегрированного гистологического, иммуногистохимического, а в некоторых случаях и молекулярно-генетического исследования опухолевого субстрата. Руководство «Патология и генетика опухолей кроветворной и лимфоидной тканей», опубликованное Всемирной Организацией Здравоохранения в 2001 г. и получившее у специалистов обиходное название «Классификация ВОЗ» [6], содержит описание клинико-морфологических (нозологических) форм опухолей гемопоэтического происхождения. В раздел опухолей лимфоидной ткани включены неходжкинские лимфомы и лимфома Ходжкина. Описание неходжкинских лимфом содержит перечень клинико-морфологических рубрик, не имеющих иерархической соподчиненности, которая бы отражала признаки биологического сходства и различия таксономических единиц. Поэтому, строго говоря, руководство «Патология и генетика опухолей кроветворной и лимфоидной тканей» является не классификацией, а перечнем отдельных форм опухолей. Рубрики описываются следующими признаками: 1. Эпидемиологическая характеристика. 2. Морфология (гистология и цитология). 3. Иммунофенотип. 4. Генетические признаки. 5. Первичная локализация. 6. Характер диссеминации. 7. Клиническое течение и прогноз. Описание каждой рубрики является консенсусом международной группы экспертов патоморфологов, онкологов и гематологов, что обеспечивает глобальность применения этой классификации и возможность сравнения результатов медикобиологических и клинических исследований в области онкогематологии. Классификация ВОЗ опухолей лимфоидной ткани (2001 г.) Название опухоли Опухоли из предшественников В-лимфоцитов В-клеточные опухоли В-лимфобластный лейкоз 1 /лимфома из предшественников В-клеток /3 1 (острый лимфобластный лейкоз из предшественников В-клеток)9728/3 2 В-клеточные опухоли с фенотипом зрелых лимфоцитов Хронический лимфоцитарный лейкоз 1 / 9823/3 1 лимфоцитарная лимфома /3 2 В-клеточный пролимфоцитарный лейкоз 9833/3 Лимфоплазмоцитарная лимфома 9671/3 Селезеночная лимфома маргинальной зоны 9689/3 Волосатоклеточный лейкоз 9940/3 Плазмоклеточная миелома 9732/3 Моноклональная гаммапатия неопределённого значения 9765/1 Солитарная плазмоцитома 9731/3 Внекостная плазмоцитома 9734/3 Первичный амилоидоз 9769/1c Болезни тяжёлых цепей 9762/3 Экстранодальная В-клеточная лимфома маргинальной зоны 9699/3 лимфоидной ткани, ассоциированной со слизистыми оболочками (MALT-лимфома) Нодальная В-клеточная лимфома маргинальной зоны 9699/3 Фолликулярная лимфома 9690/3 (Начало. Продолжение классификации на след. стр.) ПРАКТИЧЕСКАЯ ОНКОЛОГИЯ Т. 5, Код

2 Practical oncology Название опухоли Код Лимфома из клеток зоны мантии 9673/3 Диффузная крупноклеточная В-клеточная лимфома 9680/3 Медиастинальная крупноклеточная В-клеточная лимфома 9679/3 Внутрисосудистая крупноклеточная В-клеточная лимфома 9680/3 Первичная лимфома серозных полостей 9678/3 Лимфома Бёркитта 1 / 9687/3 1 лейкоз Бёркитта /3 2 В-клеточные лимфопролиферативные процессы с неопределенным опухолевым потенциалом Лимфоматоидный гранулематоз 9766/1 Посттрансплантационное лимфопролиферативное заболевание, полиморфноклеточное 9970/1 Т-клеточные опухоли Опухоли из предшественников Т-лимфоцитов Т-лимфобластный лейкоз 1 / 9837/3 1 лимфома из предшественников Т-клеток 2 (острый лимфобластный лейкоз из предшественников Т-клеток)9729/3 2 T- и NK-клеточные опухоли с фенотипом зрелых лимфоцитов Лейкозы и первично диссеминированные лимфомы Т-клеточный пролимфоцитрный лейкоз 9834/3 Т-клеточный лейкоз из крупных гранулярных лимфоцитов 9831/3 Агрессивный NK-клеточный лейкоз 9948/3 Т-клеточный лейкоз / лимфома взрослых 9827/3 Кожные лимфомы Грибовидный микоз 9700/3 Синдром Сезари 9701/3 Первичная кожная крупноклеточная анапластическая лимфома 9718/3 Лимфоматоидный папулёз 9718/1 Другие экстранодальные лимфомы Экстранодальная NK/T-клеточная лимфома, назальный тип 9719/3 Т-клеточная лимфома типа энтеропатии 9717/3 Гепатолиенальная Т-клеточная лимфома 9716/3 Панникулитоподобная Т-клеточная лимфома подкожной клетчатки 9708/3 Лимфомы лимфатических узлов Ангиоиммунобластная Т-клеточная лимфома 9705/3 Лимфома из клеток с иммунофенотипом периферических Т-лимфоцитов, неуточнённая 9702/3 Анапластическая крупноклеточная лимфома 9714/3 Опухоль неопределенной дифференцировки Бластная NK-клеточная лимфома 9727/3 Лимфома Ходжкина Лимфогранулематоз, нодулярный тип лимфоидного преобладания 9659/3 Классическая лимфома Ходжкина, нодулярный склероз 9663/3 Классическая лимфома Ходжкина, смешанно-клеточный вариант 9652/3 Классическая лимфома Ходжкина, с большим количеством лимфоцитов 9651/3 Классическая лимфома Ходжкина, с истощением лимфоидной ткани 9653/3 Морфологические особенности опухолей лимфоидной ткани (многообразие вариантов, сходство нормальных и опухолевых клеток, сходство некоторых гистологических вариантов лимфом, сходство реактивных процессов и опухолей лимфоидной ткани, неоднозначный или аберрантный иммунофенотип опухолевых клеток) определяют способы получения и исследования биопсийного материала. Материал для морфологического исследования лимфатического узла может быть получен с помощью аспирационной биопсии (взвесь клеток), пункционной биопсии (столбик ткани), открытой инцизионной биопсии (фрагмент лимфатического узла) и открытой эксцизионной биопсии (весь лимфатический узел или конгломерат лимфатических узлов). Тонкоигольная аспирационная биопсия увеличенного лимфатического узла позволяет провести цитологическую диагностику метастазов рака и получить материал для микробиологического исследования при инфекционных процессах. Однако цитологическое исследование пунктата при лимфопролиферативных заболеваниях не должно быть единственным методом диагностики. Из-за значительного морфологического сходства нормальных и опухолевых лимфоидных клеток и невозможности исследовать тканевую архитектонику в подавляющем большинстве случаев, с помощью цитологического 170 ПРАКТИЧЕСКАЯ ОНКОЛОГИЯ Т. 5,

3 Practical oncology исследования не удается установить нозологический диагноз опухоли лимфоидной ткани. Диагноз опухоли лимфоидной ткани должен основываться на гистологическом и иммуногистохимическом исследовании биоптата, полученного при эксцизионной или инцизионной биопсии лимфатического узла. Иммуногистохимическое исследование опухолей лимфоидной ткани является методом выбора при необходимости дифференциальной диагностики опухолей с выраженным сходством гистологического строения [4]. Пункционная биопсия позволяет получить столбик ткани, размеры которого зависят от технических характеристик пункционной иглы. Объем биоптата может быть достаточным для гистологического исследования, цель которого подтвердить рецидив лимфомы или обнаружить трансформацию лимфомы в случаях ранее установленного диагноза. Пункционная биопсия, проводимая под контролем лучевых методов визуализации (УЗИ, рентгеновская компьютерная томография), в некоторых случаях бывает единственным способом получения фрагмента опухоли для гистологического исследования из труднодоступных мест (забрюшинное пространство и др.). Специфичность рутинных гистологических методов для дифференциальной диагностики внутри групп морфологически сходных лимфом в большинстве случаев недостаточна. Применение классификации ВОЗ опухолей лимфоидной ткани в практической работе обусловлено возможностью использования иммуногистохимического метода. С целью дифференциальной диагностики необходимо выбрать рациональный состав панели иммунологических маркеров (антител), который позволяет различить гистологически сходные варианты лимфом между собой [1]. Общие принципы иммуногистохимического исследования в диагностике лимфом предусматривают применение в каждом случае панели антител (набор, составленный в соответствии с диагностической гипотезой, возникшей в результате рутинного гистологического исследования биоптата), а не одного какого-либо антитела, и учете комбинации позитивных и негативных результатов реакции в соответствии с известной информацией о морфологическом строении опухоли и иммунофенотипе опухолевых клеток [2]. В основе гистологического исследования биопсий лимфатических узлов, как и всех других органов и тканей, лежит детальное исследование тканевой структуры (архитектоники) и клеточного состава биоптата [3]. Гистологическое исследование препаратов, окрашенных гематоксилином эозином или азур II эозином, позволяет отнести исследуемую опухоль лимфоидной ткани к одной из групп лимфом, объединенных выраженным морфологическим сходством. Признаки, объединяющие лимфомы в группы сходного гистологического строения: 1) пролиферация бластных клеток, 2) диффузная пролиферация мелких клеток, 3) диффузная пролиферация крупных клеток, 4) фолликулярный рост лимфоидной ткани, 5) нодулярный характер роста опухолевой ткани, 6) анапластическая морфология лимфоидных клеток, 7) диффузная полиморфноклеточная лимфоидная пролиферация, 8) лимфогранулематозоподобное строение опухоли. Диффузная пролиферация лимфоидных клеток с бластной морфологией характеризуется замещением ткани лимфатического узла довольно однообразным пролифератом из клеток среднего размера (в 1,5 2 раза больше ядра малого лимфоцита). Ядра этих клеток округлые, правильной формы или с неровными, иногда зазубренными контурами. Цитоплазма может быть различима в виде узкого сероватого ободка. Много фигур митозов. Ключевым признаком, определяющим бластную морфологию опухолевых клеток, является строение ядра. Гетерохроматин в ядрах имеет однородное пылевидное, зернистое или мелкоглыбчатое строение. В некоторых случаях отчетливо видно сетчатое и нежно петлистое строение хроматина, имеющего вид тонких нитей. Гетерохроматин равномерно распределен по всему объему ядра. Ядра содержат 1 3 небольших полиморфных ядрышка. В отдельных случаях бласты могут содержать в ядрах довольно грубый хроматин в виде мелких глыбок, несколько отличающихся своими размерами, хроматин может быть распределен с увеличением его количества возле ядерной мембраны. К опухолям подобного строения относятся лимфобластные лимфомы из клеток-предшественников В-лимфоцитов, лимфобластные лимфомы из клеток-предшественников Т-лимфоцитов и бластоидный вариант лимфомы из клеток зоны мантии. Гистологическое исследование не позволяет дифференцировать лимфобластные лимфомы, отличающиеся своей принадлежностью к В- или Т-клеточной линии. Характерным отличием бластоидного варианта лимфомы из клеток зоны мантии является довольно отчетливая зазубрина в ядре опухолевых клеток или даже глубокая щель, что нехарактерно для лимфобластных лимфом. Клетки лимфобластных лимфом в некоторых случаях, особенно в биоптатах опухоли средостения, образуют своеобразные параллельные ряды клеток, разделенные едва различимыми пучками коллагеновых волокон. Лимфобластные лимфомы из клеток-предшественников В-лимфоцитов обнаруживают цитоплазматическую экспрессию пан-в-клеточного антигена CD79α, значительно реже экспрессируется другой пан-в-клеточный антиген CD20, поэтому в составе дифференциально-диагностической панели предпочтение следует отдать антителам к CD79α. Бластоидный вариант лимфомы из клеток зоны мантии также характеризуется экспрессией CD79α. Лимфобластные лимфомы из клеток-предшественников Т-лимфоцитов в подавляющем большинстве случаев демонстрируют интенсивное цитоплазматическое окрашивание с антителами к пан-т-клеточному антигену CD3, экспрессия другого пан-т-клеточного анти- ПРАКТИЧЕСКАЯ ОНКОЛОГИЯ Т. 5,

4 гена CD5 обнаруживается реже. Экспрессия CD5 характерная черта бластоидного варианта лимфомы из клеток зоны мантии, В-клеточной опухоли, которая никогда не экспрессирует CD3. Необходимо помнить о возможности коэкспрессии CD3 и CD79α в некоторых случаях лимфобластных лимфом из клеток-предшественников Т-лимфоцитов, но в этих случаях CD79α экспрессируется слабо или только в некоторых клетках. Лимфобластные лимфомы вне зависимости от линейной принадлежности экспрессируют TdT терминальную деоксинуклеотидилтрансферазу, которая никогда не обнаруживается в клетках опухолей с иммунофенотипом периферических лимфоцитов, к которым относится бластоидный вариант лимфомы из клеток зоны мантии. Лимфобластные лимфомы не экспрессируют циклин D1, его обнаружение в виде отчетливого окрашивания ядер большинства клеток отличает бластоидный вариант лимфомы из клеток зоны мантии. Цитоплазматическое окрашивание неспецифично и диагностического значения не имеет. Диффузная пролиферация мелких лимфоидных клеток практически не оставляет сомнений в опухолевой природе процесса при достаточном объеме исследуемой ткани. Обычно обнаруживаются объемные опухолевые массы монотонного строения, замещающие организованную лимфоидную ткань. Характерен инфильтративный рост за переделы капсулы лимфатического узла в перинодальную жировую ткань, мономорфный клеточный состав и более или менее выраженные признаки клеточной атипии. Диагностические проблемы возникают при исследовании небольших или сильно деформированных биоптатов, когда трудно оценить структуру ткани и строение клеток. В подавляющем большинстве случаев опухоли диффузного строения из мелких клеток имеют В-клеточный фенотип, очень редким исключением может быть Т-пролимфоцитарный лейкоз. Если иммуногистохимическое исследование указывает на В-линейное происхождение лимфомы мелкоклеточного строения, то круг дифференциальной диагностики ограничивается лимфоцитарной лимфомой, лимфомой маргинальной зоны, лимфомой из клеток зоны мантии, лимфоплазмоцитарной лимфомой и фолликулярной лимфомой I степени с диффузным характером роста. Обнаружение пролиферативных центров («псевдофолликулов»), которые в препаратах, окрашенных гематоксилином эозином или азур II эозином, отличаются более светлой окраской из-за преобладания в этих участках менее «зрелых» клеток с меньшим содержанием гетерохроматина в ядрах пролимфоцитов и параиммунобластов, позволяет довольно уверенно диагностировать лимфоцитарную лимфому. Опухолевые клетки экспрессируют CD5, отсутствие ядерной экспрессии циклина D1 позволяет отличить лимфоцитарную лимфому от другой В-клеточной опухоли, экспрессирующей CD5 лимфомы из клеток зоны Practical oncology мантии, для которой не характерно появление пролиферативных центров. При наличии резидуальных лимфоидных фолликулов, окруженных кольцевидными широкими слоями клеток с угловатыми ядрами и объемной бледной цитоплазмой, которые могут заполнять все межфолликулярное пространство, необходимо в первую очередь исключить В-клеточную лимфому маргинальной зоны. При экстранодальной локализации опухоли такого строения для диагноза MALT-лимфомы необходимо наличие всех гистологических признаков, характерных для нее В-клеток маргинальной зоны/моноцитоидных В-клеток, реактивных лимфоидных фолликулов, лимфоэпителиальных повреждений, малых лимфоцитов с возможной примесью плазматических клеток, активированных лимфоидных клеток. Отсутствие среди гистологических признаков опухоли лимфоэпителиальных повреждений и реактивных лимфоидных фолликулов не противоречит диагнозу MALT-лимфомы, который должен быть подтвержден отсутствием экспрессии CD5 и циклина D1 [5]. Фолликулярные лимфомы с диффузным характером роста встречаются редко. В эту категорию чаще попадают случаи фолликулярных лимфом с преимущественно диффузным характером роста (зоны с фолликулярным характером роста есть, но занимают менее 25%), которые из-за недостаточного объема биопсированной ткани (инцизионная или пункционная биопсия) не содержат зон фолликулярного роста. Диффузные зоны роста фолликулярной лимфомы I степени могут быть весьма похожи на лимфоцитарную лимфому, лимфому из клеток зоны мантии и В-клеточные лимфомы маргинальной зоны. Специфичных гистологических признаков для дифференциальной диагностики фолликулярных лимфом I степени с диффузным характером роста нет, иммуногистохимическое исследование позволяет выявить экспрессию CD10 (нехарактерную для В-клеточных лимфом маргинальной зоны), отсутствие экспрессии CD5 и циклина D1 (дифференциальная диагностика с лимфоцитарной лимфомой и лимфомой из клеток зоны мантии). Плазмоцитарная дифференцировка опухолевых клеток не является уникальным свойством лимфоплазмоцитарной лимфомы и встречается при лимфоцитарных лимфомах, фолликулярных лимфомах и В-клеточных лимфомах маргинальной зоны. Диагноз лимфоплазмоцитарной лимфомы может быть установлен методом исключения в тех случаях, когда характерные гистологические признаки других лимфом отсутствуют. К этим признакам относят псевдофолликулы, фолликулярный рост опухоли, наличие клеток маргинальной зоны или моноцитоидных В-клеток. Фолликулярный рост лимфоидной ткани означает В-клеточную природу опухолевого или гиперпластического процесса, поэтому для установления диагноза в иммуногистохимическом исследовании с антителами к В-линейным антигенам, строго говоря, нет необходимости. 172 ПРАКТИЧЕСКАЯ ОНКОЛОГИЯ Т. 5,

5 Practical oncology Опухолевые фолликулы при фолликулярных лимфомах обнаруживаются во всех анатомических зонах лимфатического узла. Фолликулы чаще имеют однообразную форму и примерно одинаковые размеры, чем отличаются от реактивных фолликулов при гиперпластических процессах в лимфатических узлах. Опухолевые фолликулы могут располагаться так тесно, что деформируют друг друга и приобретают отчасти полигональную форму. Тем не менее, между фолликулами в фолликулярной лимфоме практически всегда удается различить более или менее выраженную Т-зону, которая содержит малые лимфоциты, посткапиллярные венулы. Тщательное исследование под большим увеличением межфолликулярных пространств в фолликулярных лимфомах позволяет всегда обнаружить там центроциты мелкие угловатые клетки, которые в норме не обнаруживаются вне лимфоидных фолликулов, и крупные лимфоидные клетки с признаками атипии в виде ядер с глубокими вдавлениями и неправильными контурами ядра. Опухолевые фолликулы не окружает слой малых лимфоцитов, называемый зоной мантии. Четкие концентрические слои малых лимфоидных клеток признак, характерный для гиперпластического процесса. Центроциты и центробласты образуют довольно однородную смесь и для опухолевых фолликулов поляризация строения нехарактерна. Митотическая и пролиферативная (Ki-67) активность клеток фолликулярной лимфомы обычно невелика, почти всегда она меньше, чем в реактивных фолликулах. Макрофаги в ткани фолликулярной лимфомы почти не фагоцитируют, тогда как в реактивных светлых центрах размножения фолликулов легко обнаружить фагоцитоз обломков ядерного вещества. Внеклеточные белковые эозинофильные депозиты тоже редко обнаруживаются в опухолевых фолликулах, что отличает лимфому от реактивных изменений. Если при иммуногистохимическом исследовании с помощью антител к легким цепям иммуноглобулинов удается обнаружить экспрессию клетками фолликулярных центров только одного какого-либо типа цепей (только каппа- или только лямбда-цепей), то процесс считают моноклональным и почти наверняка опухолевым. Применение этого метода сильно ограничивает выраженное фоновое окрашивание, обусловленное иммуноглобулинами тканевой жидкости. Частота обнаружения экспрессии BCL-2 протеина в фолликулярных лимфомах из крупных клеток (III степень) приближается к 76%, в лимфомах из мелких и крупных клеток (II степень) к 86% и в лимфомах из мелких клеток (I степень) к 100%. В нормальных В-клетках зародышевых центров отсутствует экспрессия протеина BCL-2. Нодулярный (узловатый) тип роста опухолевой ткани создает в лимфоме относительно однообразные шарообразные структуры из стромальных элементов. Пространственная организация узлов может быть подчеркнута при выявлении стромы опухоли, в одних случаях это характерное строение ретикулинового каркаса (импрегнация солями серебра), в других сеть из фолликулярных дендритических клеток (экспрессия CD21, CD23). Нодулярные структуры могут обнаруживаться в лимфоме из клеток зоны мантии, в В-клеточных лимфомах маргинальной зоны, в лимфоцитарной лимфоме и, по определению, в лимфогранулематозе с нодулярным типом лимфоидного преобладания. Принципиальным отличием лимфогранулематоза с нодулярным типом лимфоидного преобладания от всех других лимфом с нодулярным характером роста является клеточный состав лимфоидной ткани в узлах: при лимфогранулематозе это массив неопухолевых лимфоидных клеток, гистиоцитов и малочисленные разрозненные крупные опухолевые клетки, а в лимфоме из клеток зоны мантии, в В-клеточных лимфомах маргинальной зоны и лимфоцитарной лимфоме это опухолевые В-клетки и незначительное количество клеток реактивного компонента. Такое различие позволяет определить две ветви дифференциальной диагностики. Одно направление будет соответствовать анализу опухолевой ткани в соответствии с цитологическим составом и иммунофенотипом В-клеточных лимфом из мелких лимфоидных клеток, а другое направление будет нацелено в первую очередь на изучение структуры и фенотипа крупных опухолевых клеток (L&H варианта клеток Березовского Штернберга Рид) и во вторую их микроокружения. Для решения о направлении дифференциальной диагностики целесообразно иммуногистохимическое исследование разбить на два этапа. На первом этапе следует применить антитела к пан-т- и пан-в-клеточным антигенам (CD3 и CD20). Если в результате будут обнаружены крупные клетки с атипичными ядрами многодольчатого строения и экспрессией на клеточной мембране CD20, часто окруженные кольцом малых Т-лимфоцитов, то дальнейшее исследование должно быть направлено на подтверждение диагноза лимфогранулематоза с нодулярным типом лимфоидного преобладания и исключение классических форм лимфогранулематоза (СD30, EMA, CD57). Альтернативное направление дифференциальной диагностики выбирают, если обнаруживаются опухолевые узловатые структуры из мелких В-клеток (CD5, CD10, CD23, CyD1). Обнаружение хотя бы одной нодулярной структуры характерного строения в ткани, имеющей в остальном диффузный тип роста, исключает диагноз В-клеточной лимфомы с большим количеством Т-клеток. Диффузная полиморфноклеточная опухолевая лимфоидная пролиферация при первичной локализации в лимфатических узлах в большинстве случаев связана с ангиоиммунобластной Т-клеточной лимфомой или лимфомой из клеток с иммунофенотипом периферических Т-лимфоцитов, неуточнённой. Экстранодальная первичная локализация лимфомы полиморфноклеточного строения характерна для экстранодальной NK/ T-клеточной лимфомы назального типа, подкожной пан- ПРАКТИЧЕСКАЯ ОНКОЛОГИЯ Т. 5,

6 Practical oncology никулитоподобной Т-клеточной лимфомы и Т-клеточной лимфомы типа энтеропатии. Вполне чувствительными и специфичными для предварительного гистологического диагноза следует считать следующие морфологические признаки принадлежности неходжкинских лимфом полиморфноклеточного строения к Т-клеточному типу: 1) диффузный характер роста лимфомы с поражением в начальных стадиях развития опухоли паракортикальной зоны; 2) появление большого количества посткапиллярных венул с набухшим эндотелием; 3) гнездный вид расположения (компартментализация) опухолевых клеток с образованием групп, разделенных тонкими пучками коллагеновых волокон, 4) широкие вариации размеров и формы ядер, отсутствие клеток с расщепленными ядрами, 5) клетки лимфомы имеют светлую цитоплазму с четкой мембраной, иногда образуя рисунок «булыжной мостовой», 6) наличие полиморфных клеток, в том числе подобных клеткам Березовского Штернберга Рид, 7) примесь гистиоцитов, эпителиоидных клеток, эозинофильных лейкоцитов, плазматических клеток. Строение ангиоиммунобластной Т-клеточной лимфомы отличается наличием резидуальных фолликулов в пораженном лимфатическом узле, довольно часто эти фолликулы имеют вид «выгоревших», т.е. таких, которые имеют малые размеры с малочисленными активированными клетками в своем составе на фоне фиброза и гиалиноза. Другой особенностью является очаговая пролиферация фолликулярных дендритических клеток, особенно интенсивно выраженная возле посткапиллярных венул с набухшим эндотелием. Т-клеточную природу опухоли подтверждает экспрессия Т-линейных антигенов лимфоидными клетками малого, среднего и крупного размера. Нередко встречаются крупные активированные В-клетки, относящиеся вместе с малыми В-лимфоцитами, плазматическими клетками, гистиоцитами и эозинофильными гранулоцитами к реактивному компоненту. Лимфомы из клеток с иммунофенотипом периферических Т-лимфоцитов, неуточненные, могут у разных больных существенно отличаться тканевой организацией и клеточным составом. Это позволяет выделить в опухоли с иммунофенотипом периферических Т-клеток гистологические (цитологические) варианты: плеоморфноклеточные, лимфоэпителиоидноклеточный, Т-зоны. Но дифференциальные признаки мало специфичны и не имеют явной связи с клиническим течением опухоли, поэтому в практической работе выделение гистологических вариантов необязательно. Гистологическое строение и цитологический состав экстранодальных T- и NK-клеточных лимфом не обнаруживают сколько-нибудь существенных особенностей, которые могли бы иметь дифференциально-диагностическое значение. Для экстранодальной NK/T-клеточной лимфомы назального типа характерен ангиоцентрический и ангиодеструктивный рост опухоли, который становится причиной обширных циркуляторных некрозов, но эти признаки могут обнаруживаться и в других опухолях. Цитотоксические свойства опухолевых клеток становятся еще одной причиной некрозов в опухоли, а также программированной клеточной гибели клеток апоптоза. Иммуногистохимическое исследование ткани, фиксированной в формалине и залитой в парафин, может не разрешить вопрос о T- или NK-линейной принадлежности лимфомы. Большинство Т-клеточных лимфом может быть диагностировано при иммуногистохимическом исследовании парафиновых срезов материала, фиксированого в формалине. Используют антитела к CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD45RO и CD43. Весьма характерным является аберрантный иммунофенотип с утратой экспрессии каких-либо пан-т-клеточных антигенов или невозможной в норме коэкспрессией антигенов. Опухоли с крупноклеточным компонентом обнаруживают от слабой до умеренной силы экспрессию CD30, характерную для активированных лимфоидных клеток. Чаще CD30+ клетки располагаются периваскулярно. Эти случаи не следует относить к анапластическим крупноклеточным лимфомам. NK-клетки обнаруживаются с помощью антител к CD16, CD56, CD57, эти же маркеры выявляются на цитотоксических Т-клетках. Истинные NK-клеточные опухоли встречаются редко, к ним относятся ангиоцентрические лимфомы верхних дыхательных путей (назальные) и кожи, мягких тканей, печени, селезенки, желудочнокишечного тракта, яичек (назального типа). Лимфомы неотличимого морфологического строения могут быть Т-клеточными, но они тоже CD56 позитивны. Важно подчеркнуть, что феномен ангиоцентричности лимфопролиферативного процесса не специфичен для какого-то вида лимфомы и может обнаруживаться как в Т-клеточных опухолях (крупноклеточная анапластическая лимфома), так и в NK-клеточных (назальные ангиоцентрические лимфомы), и в В-клеточных лимфомах (лимфоматоидный гранулематоз в легких). В некоторых случаях особенности гистологического строения опухоли лимфоидной ткани, неоднозначность результатов, полученных в результате иммунофенотипирования или аберрантный иммунофенотип опухолевых клеток, делают невозможной верификацию диагноза лимфомы. Это требует применения методов молекулярной генетики, которые позволяют обнаружить диагностически важные неслучайные изменения генома опухолевых клеток [7]. Дифференциальная диагностика реактивных гиперпластических процессов лимфоидной ткани и лимфом с помощью методов молекулярной генетики основывается на диагностике моноклональности. Идентичность перестройки генов тяжелых цепей иммуноглобулинов или генов Т-клеточных рецепторов в изучаемой популяции клеток означает моноклональность и расценивается как аргумент, свидетельствующий в пользу опухолевой природы процесса. Некоторые неходжкинские лимфомы в своем патогенезе тесно связаны с молекулярными дефектами, 174 ПРАКТИЧЕСКАЯ ОНКОЛОГИЯ Т. 5,

7 Practical oncology которые могут иметь диагностическое значение. Примером диагностически важной неслучайной транслокации, связанной с лимфомами из клеток зоны мантии, может быть t(11;14)(q13;q32), в результате которой возникает сверхэкспрессия bcl-1 (циклин D1/PRAD 1). Примерно 85 90% всех фолликулярных лимфом характеризуется неслучайной генетической аномалией t(14;18)(q32;q21). В результате наступает дерегуляция экспрессии нормального гена, располагающегося на 18 хромосоме, известного как bcl-2. Этот ген кодирует 26 кда белок ядерной мембраны и эндоплазматической сети, который с помощью неизученного механизма не дает погибнуть клетке путем апоптоза. Сверхэкспрессия bcl-2 в клетках фолликулярной лимфомы обеспечивает удлинение времени жизни опухолевых клеток, препятствуя их программированной гибели. Транслокация bcl-2 не является патогномоничной для фолликулярных лимфом и встречается в некоторых случаях диффузных В-клеточных крупноклеточных лимфом. Диагностически и прогностически важной является транслокация t(2;5)(p23;q35), характерная для анапластических крупноклеточных лимфом. Транслокация ведет к слиянию гена нуклеофосмина (NMP) и гена киназы анапластической лимфомы (ALK1). Это приводит к синтезу химерного белка, который обнаруживается в значительной части случаев анапластических крупноклеточных лимфом. Другими примерами являются транслокация bcl-3 t(14;19)(q32;q13), обнаруженная в лимфоцитарных лимфомах; перестройка bcl-6 в диффузных В-клеточных крупноклеточных лимфомах; престройка c-myc, связанная с t(8;14)(q24;q32) в лимфомах Беркитта; pax-5 транслокация t(9;14)(pl 3;q32), выявленная в лимфоплазмоцитарных лимфомах; bcl-10 перестройка, выявленная в MALT-лимфомах при t(1;14)(p22;q32) или другой генетический дефект MALT-лимфом t(11;18)(q21;q21), в результате которого экспрессируется аберрантный протеин AP12-MLT. В заключение следует отметить, что нередко клиническая характеристика опухолевого процесса (в первую очередь, локализация) могут иметь ключевое значение в дифференциальной диагностике, поскольку не только морфологические признаки лимфом, но и иммунофенотип опухолевых клеток неспецифичны, а молекулярногенетический анализ невозможен из-за разрушения ДНК при гистологической обработке биопсированной ткани или недоступен. Необходимо помнить, что связь между цитологической характеристикой состава опухоли (так называемая гистологическая «степень злокачественности» неходжкинских лимфом) и течением заболевания обнаружена не была, поэтому клиническая практика требует точного нозологического диагноза опухолей лимфоидной ткани на основании интегрированного гистологического, иммуногистохимического, а в некоторых случаях и молекулярно-генетического исследования опухолевого субстрата. Литература 1. Chan J. K. C. Tumors of the lymphoreticular system, including spleen and thymus // Diagnostic histopathology of tumors. Vol. 2 / Fletcher C. D. M. (ed.). New York: Churchill Livingstone, P Dabbs D. J. Diagnostic immunohistochemistry. New York: Churchill Livingstone, xiv. 673 p. : ill. 3. Feller A. C., Diebold J., Lennert K. Histopathology of nodal and extranodal non-hodgkin s lymphomas (based on the WHO classification). 3rd ed. Berlin ; New York: Springer, xii. 428 p. 4. Hayat M. A. Microscopy, immunohistochemistry, and antigen retrieval methods : for light and electron microscopy. New York: Kluwer Academic/Plenum Publishers, xviii. 355 p. 5. Isaacson P. G., Norton A. J. Extranodal lymphomas. Edinburgh ; New York: Churchill Livingstone, viii. 340 p. 6. Jaffe E. S., Harris N. L., Stein H., Vardiman J. W., eds. WHO Classification of Tumours. Pathology and genetics of tumours of haematopoietic and lymphoid tissues. Lyon: IARC Press, p. 7. Knowles D. M. Neoplastic hematopathology. 2nd ed. Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins, xxiv p. 8. Lennert K., Feller A. C. Histopathology of non-hodgkin s lymphomas (based on the updated Kiel Classification). 2nd ed. Berlin; New York: Springer-Verlag, xiv. 312 p. Поступила в редакцию г. ПРАКТИЧЕСКАЯ ОНКОЛОГИЯ Т. 5,

docplayer.ru

ДИНАМИКА ИММУНОФЕНОТИПА РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ В ПРОЦЕССЕ ЛЕЧЕНИЯ

Статья опубликована в рамках: Выходные данные сборника:

ДИНАМИКА ИММУНОФЕНОТИПА РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ В ПРОЦЕССЕ ЛЕЧЕНИЯ

Бондаренко Игорь Николаевич

профессор, д-р мед. наук, зав. кафедрой онкологии

и медицинской радиологии ГУ «ДМА» МОЗ Украины, г. Днепропетровск

Завизион Виктор Федорович

канд. мед. наук, доцент кафедры онкологии и медицинской радиологии ГУ «ДМА» МОЗ Украины, г. Днепропетровск

Куник Анна Владимировна

магистрант кафедры онкологии и медицинской радиологии

ГУ «ДМА» МОЗ Украины, г. Днепропетровск

Асеев Алексей Игоревич

канд. мед. наук, ассистент кафедры онкологии

и медицинской радиологии ГУ «ДМА» МОЗ Украины, г. Днепропетровск

E-mail: 

Рак молочной железы в структуре заболеваемости и смертности от злокачественных заболеваний у женщин в Украине, а также странах Европы и Америки занимает первое место [7]. Статистические данные последних лет свидетельствуют о том, что в экономически развитых странах ежегодно наблюдается рост заболеваемости и смертности от рака этой локализации [12, 1], за последние тридцать лет частота случаев рака молочной железы увеличилась более чем на 20 % [10].

Рак молочной железы — это группа гетерогенных опухолей разных биологических подтипов, которые различаются по ответу на терапию и по прогнозу, что усложняет адекватное лечение. В наше время для выбора оптимальной лечебной тактики и адекватной медикаментозной терапии обязательным является установление фенотипа опухоли. По рекомендациям American Society of Clinical Oncology для определения опухолевых маркеров для рака молочной железы от 2007 года необходимым считается исследование уровня экспрессии эстрогеновых, прогестероновых рецепторов и Her-2/neu [17].

«Минимальные клинические рекомендации Европейского сообщества медицинской онкологии ESMO» 2010 года редакции рассматривают лечение первичного рака молочной железы (локальные или потенциально операбельные формы), местно распространенной и метастатической форм РМЖ.

На практике стандартом является иммуногистохимическое исследование опухоли до начала лечения. Но нередко фенотип опухоли на разных стадиях ее генеза отличается.

Изменение уровня экспрессии рецепторов опухоли может быть настоящим биологическим феноменом или результатом ошибочного выполнения исследований. Биологическими причинами называют дрейф генов, селекцию клонов клеток, гетерогенность опухоли и повреждение генного аппарата клетки внешними агентами, например, химиопрепаратами, гормонотерапией или таргетными телами [5].

По данным Американской ассоциации клинических патологов карцинома молочной железы имеет значительную гетерогенность, особенно это касается опухолей с уровнем экспрессии Her-2/neu 2+ (для ИФА метода). Около 68 % случав имеют отличающийся уровень эпидермального фактора роста при исследовании другого среза опухоли или ее метастаза (регионального или отдаленного) [8].

Разница между ИГХ статусом первичной опухоли и рецидивных очагов составляет от 15 до 40 % [2]; в 7—26 % изменяется статус Her-2/neu рецепторов [4]. Кроме того, некоторые авторы описывают, что фенотип первичной опухоли и пораженных лимфатических узлов отличается почти в 75 % случаев [15].

Изменение Her-2/neu статуса в процессе лечения может быть причиной резистентности к терапии трастузумабом [6].

Научно значимым является вопрос, как влияет неоадъювантная химиотерапия на статус эпидермального фактора роста. Согласно одному из исследований в 30 % случаев определялось минимальное изменение экспрессии Her-2/neu, а в 10 % — полное изменение статуса с положительного на отрицательный [14]. В 2006 году были опубликованы данные научного поиска влияния неоадъювантной терапии на стероидные рецепторы рака. По результатам исследования изменения были выявлены в 25 % срезов, из них приблизительно в 48 % случаев была выявлена реверсия ER и PR с положительных на отрицательные. Такая тенденция приводила к увеличению общей выживаемости, но не влияла на безрецидивную выживаемость [16].

Потеря рецепторов наблюдается чаще, чем их появление. Изменение уровня экспрессии гормональных рецепторов и HER-2 не зависит от размера, стадии и гистологической структуры первичной опухоли. Изменение экспрессии эпидермального фактора рота зависит от места метастазирования (кости, висцеральные органы или мягкие ткани). Положительная экспрессия хотя бы одного из гормональных рецепторов коррелирует с лучшим прогнозом, как и изменение рецепторов эпидермального фактора роста. Пациенты, у которых тройной негативный тип опухоли изменяется на другой тип, имеют худший прогноз [3].

Повторное определение рецепторного статуса рецидивных очагов опухоли в 20 % изменяет дальнейшую лечебную тактику [13].

Итальянские ученые исследовали влияние отличия рецепторного статуса между первичной опухолью и рецидивной на прогноз пациентов. Больные с конкордантным тройным негативным раком имеют лучший прогноз (медиана выживаемости 43,0 месяца, 95 % интервал доверия 31,2—52 месяца) по сравнению с пациентами с дискордантным triple-negative раком (медиана 15,6 месяцев, интервал доверия 95 % 11,6—30,5 месяцев). Пациенты с рецептор-положительными типами опухолей, не имеющие изменений, также имели лучший прогноз (медиана виживаемости 45,1 месяц, 95 % интервал доверия 37,1—53,9 месяцев) [9].

Мы ретроспективно проанализировали истории болезни 67 пациентов с раком молочной железы. Во всех 67 случаях были проведены первичные и повторные иммуногистохимические исследования опухолей. Все больные — женщины в возрасте от 29 до 73 лет на момент первых анамнестических проявлений болезни. Средний возраст составил 52 (±11,26) года.

63 пациентки (94,03 %) получали лечение, у 4 пациенток лечение отсутствовало. В 63 случаях больные получали химиотерапевтическое лечение. У 9 пациенток (13,43 %) в этапы лечения входила гормонотерапия, у 3 (4,48 %) — таргетная терапия (герцептином), в 6 (8,96 %) — лучевая терапия. 65 пациенток (97 %) имели в анамнезе оперативное лечение.

Согласно молекулярно-генетической классификации рака молочной железы 2005 года редакции (St. Gallen breas cancer classification — 2005), мы выделили 4 гистогенетических типа рака молочной железы: люминальный А подтип (ЕR и/или PR положительный и Her-2/neu отрицательный), люминальный В подтип (ЕR и/или PR положительный и Her-2/neu положительный), подтип с гиперэкспрессией Her-2/neu (ЕR и PR отрицательный, Her-2/neu положительный) и тройной негативный подтип (ЕR, PR и Her-2/neu отрицательный) [11]. Использование молекулярно-генетической классификации 2011 года редакции было невозможным в связи с отсутствием у подавляющего большинства пациентов статуса Ki-67.

В 30 случаях (44,78 %) определялись изменения иммуно­гистохимического статуса.

Первично люминальный А подтип определялся у 32 пациентов, в процессе лечения в 1 наблюдении он изменился на люминальный В подтип, в 5 случаях мы установили полную потерю экспрессии стероидных рецепторов (изменение на тройной негативный тип), в 2 клинических случаях — потерю рецепторов эстрогена и прогестерона и появление рецепторов эпидермального фактора роста (подтип с гиперэкспрессией Her-2/neu).

Люминальный В подтип на этапе первичной диагностики был установлен у 17 женщин с раком молочной железы. При повторном исследовании наблюдалась такая динамика: у 8 пациентов выявили потерю рецепторов Her-2/neu (конверсия в люминальный А подтип) и в 2 случаях потерю стероидных рецепторов (Her-2/neu positive рак молочной железы).

Для больных с базальным типом рака ( 7 женщин) тенденции были такие: в 2 наблюдениях конверсия в люминальный А подтип, в 1 — в люминальный В и 1 случае в тройной негативный тип.

У женщин с гиперэкспрессией Her-2/neu мы выявили в 3 случаях потерю экспрессии рецептора эпидермального фактора роста и появление стероидных рецепторов (конверсия в люминальный А подтип), в 2 случаях — переход в молекулярный В подтип и в 1 наблюдении изменение на тройной негативный тип опухоли.

В нашем регионе статистически достоверной является тенденция к изменению фенотипа опухоли у пациентов, которые на момент диагностики имели люминальный В подтип рака молочной железы.

В результате тщательного анализа с помощью методов математической статистики мы выявили ряд факторов, которые влияют на изменение уровня экспрессии маркеров биологической агрессивности опухоли. Из-за небольшого количества пациентов в группе наблюдения мы называем эти корреляции тенденциями.

Первичный фенотип опухоли (значение критерия Мана-Уитни 0,004) имеет достоверное влияние на возможности дискордантности молекулярного типа рака молочной железы при повторном иммуногистохимическом исследовании. Как было сказано выше, наибольшую тенденцию к изменению имеет люминальный В тип опухоли.

Наличие таргетной терапии в анамнезе статистически достоверно влияло на реверсию фенотипа рака. В 2 случаях зафиксирована потеря экспрессии эпидермального фактора роста, в 1 случае — стероидных рецепторов.

Лучевая терапия в 4 случаях коррелировала с изменение экспрессии Her-2/neu, в 2 наблюдения — стероидных рецепторов.

Наблюдалась тенденция к изменению молекулярного типа рака в случае изменения места взятия биопсии (например, в метаста­тическом очаге).

Статистически с изменением фенотипа опухоли коррелирует репродуктивный статус женщины на момент первичной диагностики заболевания (репродуктивный возраст или менопауза). Большинство случаев изменения статуса опухоли наблюдается в репродуктивном возрасте. Также опухоли с более низкой степенью дифференцировки имели тенденцию к изменению фенотипа в процессе лечения.

Нами были проанализированы и другие факторы, но их влияние на возможность изменения молекулярного подтипа рака молочной железы не было математически доказано. Они представлены: 1) периодом между проведением иммуногистохимических исследований, 2) типом рака молочной железы (первичный или рецидивный), 3) возрастом больной на момент диагностики заболевания, 4) наличием химиотерапии, гормонотерапии или оперативного лечения в анамнезе, 5) гистологическим типом рака, 6) степенью терапевтического повреждения по Лавниковой Г.О., 7) стадией заболевания, 8) первичным размером опухоли, наличием пораженных регионарных лимфоузлов или отдаленных метастазов на момент диагностики (TNМ-классификация).

Полученные нами результаты совпадают с мировыми данными.

Таким образом, послеоперационный материал больных, которые имели неоадъювантное лечение, первичная или метастатическая опухоли могут иметь разные показатели биологической активности. Клиническое значение такого феномена обусловлено возможным его влиянием на дальнейшую тактику ведения пациентов благодаря широкому внедрению в клинике современных медикаментозных методов лечения (химиотерапии, гормонотерапии и терапии таргетными телами). Все больше данных говорят о том, что каждый новый виток развития опухолевой ткани следует исследовать с помощью иммуногистохимических методов.

Список литературы:

  1. Семиглазов В.В., Топузов Э.Э. Рак молочной железы / Под ред. проф.. В.Ф. Семиглазова. М.: 2009, 172 с.
  2. Brennan M.J., Donegan W.L., Appleby D.E. The variability of estrogen receptors in metastatic breast cancer / Am J. Surg. — 1979, Vol. 137. — P. 260—262.
  3. Broglio K., Moulder S.L., Hsu L., Kau S. Prognostic impact of discordance/concordance of triple-receptor expression between primary tumor and metastasis in patients with metastatic breast cancer / J Clin Oncol, 2008. — Vol. 26. — Abstr 1001.
  4. Broom R., Tang P., Simmons C. Changes in estrogen receptor (ER), progesterone receptor (PR) and HER—2/neu status with time: discordance between primary and metastatic breast pathology samples / Proceedings of ASCO, 2007. — 25 Suppl. Part I. — 18S (Abstr 1024).
  5. Edgerton S.M., Moore D. II, Merkel D. ErbB-2 (HER-2) and breast cancer progression / Appl Immunohistochem Mol Morphol. — 2003, Vol. 11. — P. 214—221.
  6. Gaglia A., Arapantoni P., Valavanis C. A pilot evaluation of HER2/neu status between primary breast cancer and metastatic sites developed during trastuzumab-based therapy in patients with metastatic breast cancer (MBC) / 2005 ASCO Annual Meeting Proceedings // Journal of Clinical Oncology, 2005. — Vol 23. — № 16S. — Part I of II (June 1 Supplement). — P. 2094.
  7. Hortobagyi G.N. The global breast cancer burden: variations in epidemiology and survival / Clin Breast Cancer. — 2005, Dec. — Vol. 6(5) — P. 391—401.
  8. Jason T. Lewis, Rhett P. Ketterling, Kevin C. Halling Analysis of Intratumoral Heterogeneity and Amplification Status in Breast Carcinomas With Equivocal (2+) HER-2 Immunostaining / Am J Clin Pathol. — 2005, Vol. 124. — P. 273—281.
  9. Liedtke C., Broglio K., Moulder S., Hsu L. Prognostic impact of discordance between triple-receptor measurements in primary and recurrent breast cancer /Annals of Oncology. — Vol. 20. — Issue 12. — P. 1953—1958.
  10. Martin D. Abeloff, James O. Armitage Abeloff's Clinical Oncology, 4th ed / Philadelphia.: 2008, Chapter 95.
  11. Pathology Reporting of Breast Disease: A Joint Document Incorporating the Third Edition of the NHS Breast Screening Programme's Guidelines for Pathology Reporting in Breast Cancer Screening and the Second Edition of The Royal College of Pathologists' Minimum Dataset for Breast Cancer Histopathology. Sheffield; NHS Cancer Screening Programmes and The Royal College of Pathologists; 2005.
  12. Progress against breast cancer / 46th Annual Meeting of the American Society of Clinical Oncology. — 2007. [Электронныйресурс] — Режимдоступа. — URL: http://www.asco.org/ASCOv2/Press+Center/Latest+News+Releases/Meetings+News/Studies+Report+Progress+Against+Breast+Cancer.
  13. Simmons C., Miller N., Geddie W. Does confirmatory tumor biopsy alter the management of breast cancer patients with distant metastases? / Annals of Oncology. — Vol. 20. — Issue 9. — P. 1499—1504.
  14. Skalova H., Dundr P., Povysil C. Changes in HER2 status after neoadjuvant treatment of breast cancer / 2011 ASCO Annual Meeting // J Clin Oncol, 2011. — Vol. 29. — Abstr 11110.
  15. Systematic comparison of tumor phenotype in primary breast cancer versus corresponding lymph nodes and disease recurrences: Results of the retrospective multicenter WSG/DETECT PriMet study / 2011 ASCO Annual Meeting // J Clin Oncol, 2011. — Vol. 29. — Abstr 1038.
  16. Tacca O., Penault-Llorca F., Abrial C. Neoadjuvant chemotherapy (NCT) in 710 patients for operable breast cancer: Variation changing in hormonal receptors (HR) status / 2006 ASCO Annual Meeting Proceedings // Journal of Clinical Oncology, 2006. — Part I. Vol. 24, No. 18S (June 20 Supplement). — P. 673.
  17. Update of Recommendations for the Use of Tumor Markers in Breast Cancer / Journal of Clinical Oncology. — Vol. 25, No 33 (November 20), 2007. — P. 5287—5312.

sibac.info


Смотрите также